Anticuerpos anti-hepcindina y métodos de uso.

Anticuerpo aislado que se une a hepcidina humana de SEQ ID NO:

9, que comprende:

(a) las CDR de SEQ ID NO: 334-339,

(b) las CDR de SEQ ID NO: 344-349,

(c) las CDR de SEQ ID NO: 354-359,

(d) las CDR de SEQ ID NO: 364-369,

(e) las CDR de SEQ ID NO: 374-379,

(f) las CDR de SEQ ID NO: 384-389, o

(g) las CDR de SEQ ID NO: 394-399.

Anticuerpos anti-hepcidina y métodos de uso Campo de la invención

La invención se refiere a hepcidina, a anticuerpos que se unen a hepcidina y a su capacidad para modular la actividad de hepcidina.

Antecedentes de la invención

El hierro es un oligoelemento esencial requerido para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos vivos. El contenido en hierro en los mamíferos se regula controlando la absorción de hierro, el reciclaje de hierro y la liberación de hierro desde las células en las que se almacena. Se absorbe hierro predominantemente en el duodeno y yeyuno superior por enterocitos. Existe un mecanismo de retroalimentación que potencia la absorción de hierro en individuos que son deficientes en hierro, y que reduce la absorción de hierro en individuos con sobrecarga de hierro (Andrews, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet., 1:75 (2); Philpott, Hepatology, 35:993 (22); Beutler et al, Drug- Metab. Dispos., 29:495 (21)). Se recicla hierro a partir de glóbulos rojos degradados por macrófagos reticuloendoteliales en médula ósea, células de Kupffer hepáticas y bazo. La liberación de hierro está controlada por ferroportina, una proteína exportadora de hierro principal ubicada en la superficie celular de enterocitos, macrófagos y hepatocitos, las principales células que pueden liberar hierro al plasma. La hepcidina se une a férroportina y disminuye su actividad funcional, provocando que se internalice a partir de la superficie celular y se degrade (Nemeth etal., Science, 36:29-3, 24; De Domenico etal., Mol. Biol. Cell., 18:2569-2578, 27).

La hepcidina es un importante regulador de la homeostasis del hierro (Philpott, Hepatology, 35:993 (22); Nicolás et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA, 99:4396 (22)). Altos niveles de hepcidina humana dan como resultado niveles de hierro reducidos, y viceversa. Mutaciones en el gen de hepcidina que dan como resultado falta de actividad de hepcidina están asociadas con hemocromatosis juvenil, una enfermedad de sobrecarga de hierro grave (Roetto et al., Nat. Genet., 33:21-22, 23). Estudios en ratones han demostrado un papel de la hepcidina en el control de la homeostasis del hierro normal (Nicolás et al., Nat. Genet., 34:97-11, 23; Nicolás et al, Proc. Nati. Acad. Sci USA, 99:4596-461,22; Nicolás etal., Proc. Nati. Acad. Sel USA, 98:878-8785, 21).

Además, están acumulándose datos que implican a la hepcidina en el secuestro de hierro durante la inflamación (véase, por ejemplo, Welnstein et al., Blood, 1:3776-36781, 22; Kemna et al., Blood, 16:1864-1866, 25; Nicolás et al., J. CHn. Invest., 11: 137-144, 22; Nemeth et al., J. Clin. Invest., 113: 1271-1276, 24; Nemeth et al., Blood, 11:2461-2463, 23 y Rivera et al., Blood, 15: 1797-182, 25). Se ha observado que la expresión génlca de hepcidina se regula por incremento fuertemente tras estímulos Inflamatorios, tales como infecciones, que inducen la respuesta de fase aguda de los sistemas ¡nmunitarios innatos de vertebrados. En ratones, se mostró que la expresión génlca de hepcidina se regula por incremento por lipopolisacárido (LPS), trementina, adyuvante completo de Freund e Infecciones adenovirales, Se induce la expresión de hepcidina por la citocina inflamatoria interleuclna-6 (IL-6). También se encontró una fuerte correlación entre la expresión de hepcidina y la anemia de Inflamación en pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas, incluyendo infecciones bacterianas, fúngicas y virales.

La hepcidina humana, un péptido de 25 aminoácidos con actividad antimicrobiana y de regulación del hierro, se descubrió Independientemente por dos grupos que investigaban péptidos antimicrobianos novedosos. (Krause et al., FEBS Lett., 48:147 (2); Park et al., J. Biol. Chem., 276:786 (21)). Se ha denominado LEAP-1 (péptido antlmicrobiano expresado en el hígado). Se identificaron posteriormente un ADNc de hepcidina que codifica para un pre-propéptido de 83 aminoácidos y un pre-propéptido de 84 aminoácidos en rata y ser humano en una búsqueda de genes específicos del hígado que estaban regulados por hierro (Pigeon et al., J. Biol. Chem., 276:7811 (21)). El péptido señal N-terminal de 24 residuos se escinde en primer lugar para producir pro-hepcidina, que a su vez se procesa adicionalmente para producir hepcidina madura, encontrada en tanto sangre como orina. En orina humana, la forma predominante contiene 25 aminoácidos, aunque también están presentes péptidos más cortos de 22 y 2 aminoácidos.

El péptido maduro destaca por contener ocho residuos de cisteina unidos como cuatro puentes disulfuro. La estructura de la hepcidina se estudió por Hunter et al., J. Biol. Chem., 277:37597-3763 (22), mediante RMN usando hepcidina sintetizada químicamente con un tiempo de retención de HPLC idéntico que el de hepcidina nativa purificada a partir de orina. Hunter et al. notificaron su determinación de que la hepcidina se plegaba en una estructura de bucle en horquilla que contenía un enlace vecino (C1-C8, C2-C7, C3-C6, C4-C5). Véase también Lauth et al., J. Biol. Chem., 28:9272-9282 (25). Sin embargo, tal como se descubrió y se dio a conocer en la publicación de solicitud de patente estadounidense en tramitación junto con la presente n.° 28/213277, se determinó que la estructura de la hepcidina tenía una conectividad de enlaces disulfuro diferente de la indicada anteriormente.

Las publicaciones de solicitudes de patente estadounidense n.os 23/187228, 24/96987, 24/9699, 25/14825, 26/19339, 25/37971 y 27/224186; las patentes estadounidenses n.os 7.232.892 y 7.294.69 y la publicación internacional n.° WO 2/98444 tratan de anticuerpos frente a hepcidina.

El documento WO 29/44284 se refiere a proteínas de unión a antígeno que tienen especificidad por hepcidina, y a su uso para tratar y diagnosticar enfermedades asociadas con hepcedina.

Sumario de la invención

Se describen en el presente documento anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a hepcidina humana, métodos de producción de tales anticuerpos, métodos de uso de tales anticuerpos para detectar hepcidina, formulaciones farmacéuticas que incluyen tales anticuerpos, métodos de preparación de las formulaciones farmacéuticas y métodos de tratamiento de pacientes con las formulaciones farmacéuticas, incluyendo terapia de combinación con estimuladores de la eritropoyesis tal como se describe a continuación. También se describen ácidos nucleicos que codifican para tales anticuerpos, vectores y células huésped recombinantes que comprenden tales ácidos nucleicos, y métodos de producción de tales anticuerpos.

Se describe un anticuerpo aislado que se une a hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una KD de afinidad de menos de aproximadamente 1"8 M que presenta al menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste en: (a) al menos aproximadamente una Kd 5 veces superior a un pH de aproximadamente 5,5 o aproximadamente 6 en comparación con su Kd para dicha hepcidina a un pH de aproximadamente 7,4; (b) al menos aproximadamente un aclaramiento 5 veces más rápido de dicha hepcidina en comparación con el anticuerpo 1S1; y (c) una velocidad de disociación de aproximadamente 6x1'2 s'1 o superior a aproximadamente pH 5,5 o aproximadamente pH 6. Alternativamente, o además de una o más de las propiedades anteriores, el anticuerpo presenta al menos una de las propiedades seleccionadas del grupo que consiste en: (a) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero en al menos aproximadamente el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8% o el 9% en un ratón C57BL/6 aproximadamente 24 horas tras la administración a dicho ratón de (i) una dosis de 1 mg de dicho anticuerpo y (ii) una única dosis precomplejada de 3,7 pg de hepcidina humana con una dosis de 1 mg de dicho anticuerpo; (b) reduce el nivel de hepcidina humana total en suero en un ratón en al menos aproximadamente el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8% o el 9% aproximadamente 24 horas tras habérsele administrado a dicho ratón una única dosis de 3,7 pg de hepcidina humana, en el que dicha hepcidina se administra tres dias después de que a dicho ratón se le predosifique dicho anticuerpo; (c) da como resultado una reducción mayor de aproximadamente el 5% en la acumulación global de hepcidina sérica total en ratones tratados con dicho anticuerpo en comparación con el anticuerpo 1S1; y (d) da como resultado al menos aproximadamente una acumulación intracelular 2 veces superior de hepcidina en células HEK293 transfectadas con FcRn incubadas con dicho anticuerpo en comparación con el anticuerpo 1S1.

Además, se describe un anticuerpo aislado que se une a hepcidina humana de SEQ ID NO: 9 con una KD de afinidad de menos de aproximadamente 1CT8 M, en el que dicho anticuerpo aumenta el nivel de hierro circulante... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo aislado que se une a hepcidina humana de SEQ ID NO: 9, que comprende:

(a) las CDR de SEQ ID NO: 334-339,

(b) las CDR de SEQ ID NO: 344-349,

(c) las CDR de SEQ ID NO: 354-359,

(d) las CDR de SEQ ID NO: 364-369,

(e) las CDR de SEQ ID NO: 374-379,

(f) las CDR de SEQ ID NO: 384-389, o

(g) las CDR de SEQ ID NO: 394-399.

2. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo según la reivindicación 1.

3. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2 operativamente unida a una secuencia de control reguladora.

4. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 3 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2.

5. Método de uso de la célula huésped según la reivindicación 4 para producir un anticuerpo, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 4 en condiciones adecuadas de manera que el ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo.

6. Composición que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1 y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. Uso del anticuerpo según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que lo necesita, en el que el trastorno de la homeostasis del hierro está asociado con un nivel de hepcidina elevado.

8. Uso de la composición según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para tratar a un ser humano con un nivel de hepcidina elevado.

9. Uso de la composición según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para tratar a un ser humano con anemia.

10. Anticuerpo según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de un trastorno de la homeostasis del hierro en un sujeto que lo necesita, en el que el trastorno de la homeostasis del hierro está asociado con un nivel de hepcidina elevado.

11. Composición según la reivindicación 6 para su uso en el tratamiento de un ser humano con anemia.