Anticuerpo humanizado anti-integrina-alfa9 humana mejorado.

Un anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera seleccionadas de lo siguiente:

(a) una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº:11 y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº:17

(b) una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº:13 y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº:17, y

(c) una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº:15 y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº:9.

Anticuerpo humanizado anti-integrina-α9 humana mejorado La presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana mejorado como se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Más en particular, se refiere a un anticuerpo Y9A2 humanizado mejorado que tiene actividad de unión a una proteína integrina α9 humana para inhibir la adhesión celular dependiente de integrina α9, y actividad y/o propiedades mejoradas en comparación con el anticuerpo Y9A2 anti-integrina α9 humana de ratón. Se espera que el anticuerpo humanizado sea un fármaco para el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, enfermedades inmunitarias tales como alergias y rechazos de injertos, y otras enfermedades diversas implicadas con la integrina α9 en sus patogénesis.

Técnica antecedente La integrina, una glicoproteína de la superficie celular, es una molécula de adhesión que funciona principalmente como receptor para la adhesión celular a las matrices extracelulares (colágeno, laminina y similares) y miembros de la familia de inmunoglobulinas (ICAM-1, VCAM-1 y similares) , y actúa como mediador en la transducción de señales desde las matrices extracelulares. De ese modo, las células reciben señales desde las matrices extracelulares, y se induce la diferenciación, proliferación, muerte celular, y similares. La integrina es un heterodímero que consiste en dos subunidades, la cadena α y la cadena β; existen diferentes cadenas α y cadenas β que se dan en una gran diversidad de combinaciones, y existen 24 miembros de la superfamilia de integrinas. Los ratones con inactivación génica de las integrinas son inviables o enfermos independientemente de qué subunidad falte, lo que sugiere que las integrinas individuales son necesarias para el mantenimiento de la vida. Por lo tanto, se cree que la integrina, que transmite información en condiciones ambientales a las células para estimular sus respuestas, funciona en todas las situaciones de los fenómenos biológicos, y actúan como mediadores en una gran variedad de estados patológicos.

Como tal, la integrina es indispensable para la supervivencia de los organismos, y se cree que desempeña un papel incluso en estados patológicos; se ha informado de ciertos casos en los que su inhibición ayuda a mejorar estados patológicos. Por ejemplo, se ha aprobado un inhibidor de la integrina αIIbβ3 específica de plaquetas como fármaco terapéutico para la reestenosis tras PCTA conocido como abciximab (nombre comercial: ReoPro; Eli Lilly) . Natalizumab (nombre comercial: Antegren; empresa ELAN) , un inhibidor de α4β1 (VLA4) , se ha aprobado como fármaco terapéutico para esclerosis múltiple. El inhibidor de αvβ3 Vitaxin (empresa MEDIMMUNE) está en desarrollo en estudios clínicos por su acción inhibitoria de la neovascularización, acción inhibitoria de la activación de osteoclastos, y similares.

La integrina α9β1 se expresa en macrófagos, células NKT, células dendríticas, y neutrófilos, y supuestamente desempeña papeles importantes en la infiltración y adhesión de estas células inflamatorias, la resorción ósea y similares. Recientemente se ha informado que la integrina α9β1 está implicada en la formación de osteoclastos, y se ha propuesto su implicación en la destrucción ósea (Documento no patente 1) . Los ligandos conocidos de la misma incluyen la osteopontina truncada (OPN N-terminal) , VCAM-1, Tenascina-C y similares. Clínicamente, se han observado niveles significativamente elevados de integrina α9β1 en los tejidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide (Documento no patente 2) .

Por lo tanto, si se desarrollase un anticuerpo monoclonal que se uniese de manera específica a la proteína integrina α9 para actuar inhibiendo la adhesión celular dependiente de integrina α9 sería útil en el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de diversas enfermedades implicadas con la integrina α9 en sus patogénesis.

Los anticuerpos que se ha informado que exhiben una acción inhibitoria de la función en la integrina α9 humana son el anticuerpo monoclonal de ratón Y9A2 (Documento no patente 3) , y 1K11, 24I11, 21C5 y 25B6 (Documento de patente 1) y 28S1 (Documento de patente 2) . Los resultados experimentales in vitro han demostrado que estos anticuerpos son capaces de inhibir la adhesión celular dependiente de integrina α9 humana. Entre ellos, debido a que Y9A2 inhibe la adhesión celular a osteopontina y Tenascina-C, se considera muy prometedor como candidato a fármaco de anticuerpos contra la integrina α9.

Se debería indicar, sin embargo, que Y9A2 es un anticuerpo derivado de ratón preparado mediante la inmunización de un ratón con un antígeno, y, por lo tanto, la administración directa del mismo a un ser humano es prácticamente imposible desde el punto de vista de la seguridad (inducción de antigenicidad) y eficacia (semivida reducida) . Por lo tanto, es necesario llevar a cabo una modificación para convertir el anticuerpo en una molécula que tenga una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano a la vez que se mantiene la actividad de Y9A2, es decir, una humanización.

En la actualidad, como método de producción de un anticuerpo humanizado, lo más general es un método basado en el método que incluye injertar aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (a veces indicada más adelante en la presente memoria como CDR) como diseñó Winter et al. (documento no patente 4) . También es muy conocido que el injerto simultáneo de aminoácidos no solamente de CDR, sino también de aminoácidos de regiones distintas de CDR implicados en el mantenimiento estructural de CDR o de la unión a un antígeno, es decir, una región estructural (a veces indicada más adelante en la presente memoria como FR) , de un anticuerpo exógeno que es el donante de aminoácidos de la CDR a un anticuerpo humano que es el aceptor de la CDR, es importante 2 10

para la reproducción de la actividad inherente del anticuerpo donante (documentos no patentes 4 y 5) .

Sin embargo, la producción de un anticuerpo humanizado basada en el injerto de CDR incluye varios problemas. En primer lugar, el problema más general es que incluso una selección adecuada de los aminoácidos de FR necesarios para la reproducción de la actividad de un anticuerpo donante no puede eliminar la dificultad de obtener un anticuerpo humanizado que tenga una afinidad hacia un antígeno y una actividad biológica que supere la del anticuerpo donante.

En años recientes, se ha comercializado un gran número de anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos como productos farmacéuticos monoclonales. La dosis eficaz de cualquiera de ellos es extremadamente elevada, y es de varios mg por kg de peso corporal. Por lo tanto, los anticuerpos farmacéuticos son inevitablemente caros, lo que a su vez incrementa la carga económica de los pacientes y los costes médicos. Los factores principales que definen la dosis eficaz de un fármaco de anticuerpo incluyen la afinidad del anticuerpo hacia un antígeno y la cantidad del antígeno presente en el organismo. A partir de tales aspectos, en particular, una mejora de la afinidad de un anticuerpo hacia un antígeno conduce a una reducción de la dosis, y es una mejora extremadamente útil que también da como resultado la reducción de la carga económica de los pacientes y los costes médicos.

Para llevar a cabo una afinidad mejorada de un anticuerpo hacia un antígeno, a menudo se adopta un método que incluye la introducción de la sustitución de aminoácidos en una región variable del anticuerpo. Sin embargo, cuando el anticuerpo y el antígeno son diferentes, también varía la secuencia y la estructura estérica de los aminoácidos de CDR, así como la posición de los aminoácidos implicados en las interacciones antígeno-anticuerpo. Por lo tanto, es prácticamente imposible definir que la posición de los aminoácidos de FR a injertar junto con la CDR sea aplicable a cualquier anticuerpo.

Otro problema es que, aunque los aminoácidos de una CDR completa de un anticuerpo de ratón donante se injerten en general en un anticuerpo humano molde en la preparación de un anticuerpo humanizado basado en el injerto de CDR, una secuencia de aminoácidos de CDR derivada de un anticuerpo de ratón, que es importante para la unión a un antígeno, a veces muestra antigenicidad contra el ser humano, lo que a menudo provoca la generación de un anticuerpo anti-idiotipo.

Es decir, para la producción de un anticuerpo humanizado, la selección de un anticuerpo aceptor... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera seleccionadas de lo siguiente:

(a) una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :11 y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :17

(b) una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :13 y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :17, y

(c) una región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :15 y una región variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :9.

2. El anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1, en el que la región constante de la cadena pesada del anticuerpo es Igγ1 humano.

3. El anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1, en el que la región constante de la cadena ligera del anticuerpo es Igκ humano.

4. El anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1, en el que la región constante de la cadena pesada del anticuerpo es Igγ1 humano y la región constante de la cadena ligera del anticuerpo es Igκ humano.

5. El anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :19 y la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :25.

6. El anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :21 y la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :25.

7. El anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1, en el que la cadena pesada consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :23 y la cadena ligera consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº :27.

8. Un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1 y una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1.

9. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1.

10. Una célula hospedadora que se selecciona del grupo que consiste en los siguientes (a) y (b) ,

(a) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado antiintegrina α9 humana según la reivindicación 1 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según la reivindicación 1; y

(b) una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado antiintegrina α9 humana según la reivindicación 1 y con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado antiintegrina α9 humana según la reivindicación 1.

11. Un método para producir un anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana, que comprende una etapa de cultivo de la célula hospedadora según la reivindicación 10 para permitir la expresión del anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana.

12. Un anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana producido mediante el método según la reivindicación 11.

13. Una preparación farmacéutica para la artritis reumatoide, que comprende el anticuerpo humanizado antiintegrina α9 humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 12.

14. Un anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 12 para el uso como un medicamento.

15. El anticuerpo humanizado anti-integrina α9 humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 12 para el uso en un método para prevenir o tratar la artritis reumatoide.

concentración de anticuerpo (ng/mL)

concentración de anticuerpo (ng/mL)