ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados.

Una ADN polimerasa que comprende al menos el siguiente motivo en el dominio polimerasa:

T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N (SEC ID Nº 32);

en la que

Xb7 es un aminoácido seleccionado entre S o T;

Xb8 es un aminoácido seleccionado entre G, T, R, K o L; y

la ADN polimerasa tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con una polimerasa seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a) una ADN polimerasa CS5 (SEC ID Nº 18);

(b) una ADN polimerasa CS6 (SEC ID Nº 9);

(c) una ADN polimerasa de Thermotoga maritima;

(d) una ADN polimerasa de Thermus aquaticus;

(e) una ADN polimerasa de Thermus thermophilus;

(f) una ADN polimerasa de Thermus flavus;

(g) una ADN polimerasa de Thermus filiformis;

(h) una ADN polimerasa de Thermus sp. sps17;

(i) una ADN polimerasa de Thermus sp. Z05;

(j) una ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana;

(k) una ADN polimerasa de Thermosipho africanus;

(l) una ADN polimerasa de Thermus caldophilus;

en la que la polimerasa tiene una tasa mejorada de extensión de ácido nucleico y/o una eficacia mejorada de transcripción inversa respecto a una ADN polimerasa por lo demás idéntica, en la que Xb8 es un aminoácido seleccionado entre D, E o N.

ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados La presente invención pertenece al campo de las ADN polimerasas y a su uso en diversas aplicaciones, incluyendo extensión de cebadores de ácido nucleico y amplificación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y mantenimiento del genoma, una tarea que es primordial para transmitir de forma precisa la información genética de una generación a otra. Las ADN polimerasas funcionan en células como las enzimas responsables de la síntesis de ADN. Polimerizan desoxirribonucleósidos trifosfato en presencia de un activador metálico, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o molde polinucleotídico que se copia. In vivo, las ADN polimerasas participan en un espectro de procesos sintéticos de ADN incluyendo la replicación del ADN, la reparación del ADN, la recombinación, y la amplificación génica. Durante cada proceso sintético de ADN, el molde de ADN se copia una vez o como mucho unas pocas veces para producir réplicas idénticas. En contraste, in vitro, la replicación del ADN puede repetirse muchas veces tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.683.202 de Mullis) .

En los estudios iniciales con reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la ADN polimerasa se añadió al inicio de cada ronda de replicación de ADN (véase la patente de Estados Unidos Nº 4.683.202, supra) . Posteriormente, se determinó que podrían obtenerse ADN polimerasas termoestables de bacterias que crecen a temperaturas elevadas, y que estas enzimas tienen que añadirse solamente una vez (véase la patente de Estados Unidos Nº 4.889.818 de Gelfand y la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188 de Mullis) . A las elevadas temperaturas usadas durante PCR, estas enzimas no se inactivan de forma irreversible. Como resultado, pueden realizarse ciclos repetitivos de reacciones en cadena de la polimerasa sin añadir enzimas nuevas al inicio de cada proceso de adición sintético. Las ADN polimerasas, particularmente las polimerasas termoestables, son la clave para una gran cantidad de técnicas en estudios de ADN recombinante y en diagnóstico médico de enfermedades. Para aplicaciones de diagnóstico en particular, una secuencia de ácido nucleico diana puede ser solamente una pequeña parte del ADN o ARN en cuestión, de modo que puede ser difícil detectar la presencia de una secuencia diana de ácido nucleico sin amplificación. Debido a la importancia de las ADN polimerasas en biotecnología y medicina, sería muy ventajoso generar mutantes de ADN polimerasa que tengan propiedades enzimáticas deseadas tales como, por ejemplo, tasas de extensión de cebador mejoradas, eficacia de transcripción inversa, o capacidad de amplificación. En el documento EP 1 152 062, se describen ADN polimerasas mutantes que tienen capacidad de transcripción inversa y amplificación de secuencias de ARN por polimerasa en una reacción acoplada en un tubo. Se proporcionan métodos adicionales para la transcripción inversa y amplificación de secuencias de ácido ribonucleico (ARN) que muestran eficacia mejorada de transcripción inversa ("RT") relativa a los métodos previamente descritos de transcripción inversa a alta temperatura.

El patrón de plegamiento global de las polimerasas se parece a la mano derecha humana y contiene tres subdominios distintos de palma, dedos, y pulgar. (Véase Beese et al., Science 260:352-355, 1993) ; Patel et al., Biochemistr y 34:5351-5363, 1995) . Aunque la estructura de los subdominios de dedos y pulgar varía enormemente entre polimerasas que difieren en tamaño y en funciones celulares, los subdominios catalíticos de palma son todos superponibles. Por ejemplo, el motivo A, que interacciona con los dNTP entrantes y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, es superponible con una desviación media de aproximadamente un à entre la pol α de mamífero y las ADN polimerasas procariotas de la familia pol I (Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997) . El motivo A empieza estructuralmente en una lámina β antiparalela que contienen restos predominantemente hidrófobos y continúa hasta una hélice α. La secuencia primaria de aminoácidos de los sitios activos de la ADN polimerasa está excepcionalmente conservada. En el caso del motivo A, por ejemplo, la secuencia DYSQIELR está retenida en polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución incluyendo, por ejemplo, Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatis, y Escherichia coli. Tomadas en conjunto, estas observaciones indican que las polimerasas funcionan por mecanismo catalíticos similares.

Además de estar bien conservado, el sitio activo de las ADN polimerasas también ha demostrado ser relativamente mutable, capaces de acomodar ciertas sustituciones de aminoácidos sin reducir la actividad ADN polimerasa significativamente. (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.602.695 de Patel et al.) Dichas ADN polimerasas mutantes pueden ofrecer diversas ventajas selectivas en, por ejemplo, aplicaciones de diagnóstico y de investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácidos nucleicos. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de identificación de posiciones de aminoácidos susceptibles a mutación para producir actividad polimerasa mejorada incluyendo, por ejemplo, tasas de extensión, eficacia de transcripción inversa, o capacidad de amplificación mejoradas. La presente invención, expuesta en este documento, cumple éstas y otras necesidades.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una ADN polimerasa mutante que tiene actividad enzimática mejorada relativa a la correspondiente polimerasa no modificada y que es útil en una diversidad de aplicaciones de síntesis de ácido nucleico. En un aspecto de la invención, la ADN polimerasa comprende al menos el siguiente motivo en el dominio polimerasa:

T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N (SEC ID Nº 32) ;

donde Xb7 es un aminoácido seleccionado entre S o T; Xb8 es un aminoácido seleccionado entre G, T, R, K o L; y la ADN polimerasa tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con una polimerasa seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a) una ADN polimerasa CS5 (SEC ID Nº 18) ;

(b) una ADN polimerasa CS6 (SEC ID Nº 19) ;

(c) una ADN polimerasa de Thermotoga maritima;

(d) una ADN polimerasa de Thermus aquaticus;

(e) una ADN polimerasa de Thermus thermophilus;

(f) una ADN polimerasa de Thermus flavus;

(g) una ADN polimerasa de Thermus filiformis;

(h) una ADN polimerasa de Thermus sp. sps17;

(i) una ADN polimerasa de Thermus sp. Z05;

(j) una ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana;

(k) una ADN polimerasa de Thermosipho africanus;

(l) una ADN polimerasa de Thermus caldophilus;

donde la polimerasa tiene una tasa de extensión de ácido nucleico mejorada y/o una eficacia de transcripción inversa mejorada relativa a una ADN polimerasa por lo demás idéntica, donde Xb8 es un aminoácido seleccionado entre D, E o N. En algunas realizaciones, Xb8 es un aminoácido seleccionado entre G o K.

Diversas ADN polimerasas son susceptibles a mutación de acuerdo con la presente invención. Son particularmente adecuadas las polimerasas termoestables, incluyendo polimerasas termoestables de tipo silvestre o de origen natural de diversas especies de bacterias termófilas, así como polimerasas termoestables derivadas de dichas enzimas de tipo silvestre o de origen natural por sustitución, inserción o deleción de aminoácidos, u otra modificación. Formas no modificadas ejemplares de polimerasa incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa CS5, CS6 o Z05, o una ADN polimerasa funcional que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la mismas. Otras polimerasas no modificadas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasas de cualquiera de las siguientes especies de bacterias termófilas (o una ADN polimerasa funcional que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con dicha polimerasa) : Thermotoga maritima; Thermus aquaticus; Thermus thermophilus; Thermus flavus; Thermus filiformis; Thermus sp. sps17; Thermus sp. Z05; Thermotoga neopolitana; Thermosipho africanus; o Thermus caldophilus. Las polimerasas adecuadas también incluyen aquellas que tienen actividad transcriptasa inversa (RT) y/o la capacidad de incorporar nucleótidos no convencionales, tales como ribonucleótidos u otros nucleótidos 2'-modificados.

En algunas realizaciones, la forma no modificada de la polimerasa comprende una polimerasa quimérica. En una realización, por ejemplo,... [Seguir leyendo]

1. Una ADN polimerasa que comprende al menos el siguiente motivo en el dominio polimerasa:

T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N (SEC ID Nº 32) ; en la que Xb7 es un aminoácido seleccionado entre S o T; Xb8 es un aminoácido seleccionado entre G, T, R, K o L; y la ADN polimerasa tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con una polimerasa seleccionada entre el

grupo que consiste en:

(a) una ADN polimerasa CS5 (SEC ID Nº 18) ;

(b) una ADN polimerasa CS6 (SEC ID Nº 9) ;

(c) una ADN polimerasa de Thermotoga maritima; 15 (d) una ADN polimerasa de Thermus aquaticus;

(e) una ADN polimerasa de Thermus thermophilus;

(f) una ADN polimerasa de Thermus flavus;

(g) una ADN polimerasa de Thermus filiformis;

(h) una ADN polimerasa de Thermus sp. sps17; 20 (i) una ADN polimerasa de Thermus sp. Z05;

(j) una ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana;

(k) una ADN polimerasa de Thermosipho africanus;

(l) una ADN polimerasa de Thermus caldophilus; en la que la polimerasa tiene una tasa mejorada de extensión de ácido nucleico y/o una eficacia mejorada de

transcripción inversa respecto a una ADN polimerasa por lo demás idéntica, en la que Xb8 es un aminoácido seleccionado entre D, E o N.

2. La ADN polimerasa de la reivindicación 1, en la que Xb8 es un aminoácido seleccionado entre G o K.

3. La ADN polimerasa de la reivindicación 1, en la que la ADN polimerasa es una ADN polimerasa CS5 o una ADN polimerasa CS6, y el aminoácido en la posición 640 se selecciona entre el grupo que consiste en G, T, R, K y L.

4. La ADN polimerasa de la reivindicación 1, en la que la ADN polimerasa es una ADN polimerasa Z05, y el

aminoácido en la posición 580 se selecciona entre el grupo que consiste en G, T, R, K y L. 35

5. La ADN polimerasa de la reivindicación 1, en la que la polimerasa comprende una polimerasa quimérica, en la que la polimerasa quimérica tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la ADN polimerasa CS5 de la SEC ID Nº 18, o la ADN polimerasa CS6 de la SEC ID Nº 19.

6. La ADN polimerasa de la reivindicación 5, en la que la polimerasa quimérica comprende una o más sustituciones de aminoácido respecto a la SEC ID Nº 18 o SEC ID Nº 19 seleccionadas entre el grupo que consiste en: G46E, L329A, Q601R, D640G, I669F, S671F y E678G.

7. La ADN polimerasa de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una modificación covalente 45 térmicamente reversible.

8. La ADN polimerasa de la reivindicación 7, en la que la polimerasa que comprende la modificación covalente térmicamente reversible se produce mediante una reacción, realizada a pH alcalino a una temperatura que es menor de aproximadamente 25º C, de una mezcla de una ADN polimerasa termoestable y un anhídrido de ácido 50 dicarboxílico que tiene una fórmula general seleccionada entre el grupo que consiste en (a) fórmula I:

en la que R1 y R2 son hidrógeno o radicales orgánicos, que pueden estar unidos; y

(b) fórmula II: en la que R1 y R2 son radicales orgánicos, que pueden estar unidos, y los hidrógenos son cis.

9. Un ácido nucleico recombinante que codifica la ADN polimerasa de acuerdo con la reivindicación 1.

10. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante de la reivindicación 9.

11. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 10.

12. Un método para producir una ADN polimerasa, comprendiendo dicho método: cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 11 en condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico que codifica la ADN polimerasa.

13. Un método para realizar extensión de cebador, que comprende:

poner en contacto una ADN polimerasa de acuerdo con la reivindicación 1 con un cebador, un molde de polinucleótido, y nucleótidos libres en condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de este modo un cebador extendido.

14. Un kit para producir un cebador extendido, que comprende: al menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa de acuerdo con la reivindicación 1.

15. Una mezcla de reacción que comprende una ADN polimerasa de acuerdo con la reivindicación 1, al menos un cebador, un molde de polinucleótido, y nucleótidos libres.