Variantes del Factor IX con actividad coagulante en ausencia de su cofactor y su uso para el tratamiento de alteraciones hemorrágicas.

Una variante del factor IX (F. IX) o del factor IX activado (F.

IXa), que está caracterizada porque tiene actividadcoagulante en ausencia de su cofactor,

en la que el cofactor es el factor VIII (F. VIII) o el factor VIII activado (F. VIIIa),

comprendiendo dicha variante del factor IX o del factor IX activado al menos una sustitución de aminoácido en laposición 265 en combinación con la sustitución de aminoácido V 181I.

Variantes del Factor IX con actividad coagulante en ausencia de su cofactor y su uso para el tratamiento de alteraciones hemorrágicas La presente invención se refiere a variantes del factor IX (F. IX) , en las que la variante está caracterizada porque tiene actividad coagulante en ausencia de su cofactor. La presente invención se refiere adicionalmente al uso de estas variantes para el tratamiento y/o la profilaxis de alteraciones hemorrágicas, en particular de la hemofilia A y/o de la hemofilia B o de la hemofilia causada o complicada por anticuerpos inhibidores del F. VIII.

Antecedentes de la invención Factor de coagulación IX

El factor de coagulación sanguínea IX (F. IX) juega un papel central en la cascada de coagulación. El F. IX es una proteasa de serina tripsinoide dependiente de la vitamina K que circula en el plasma como un cimógeno inactivo de cadena única (DiScipio y col., 1977; Davie y col., 1991) . El Factor IX es activado por el factor XIa o por el factor VIIafactor tisular de una forma dependiente de Ca2+. La activación requiere la escisión de dos enlaces peptídicos por parte del complejo factor VII activado (F. VIIa) -factor tisular o el factor XI activado (F. XIa) (Fujikawa y col., 1974; Lindquist y col., 1978) para eliminar un péptido de activación de 35 residuos.

El F. IX es una proteína multidominio. Un dominio de ácido glutámico N-terminal y-carboxi (GLA) está seguido por dos repeticiones del factor de crecimiento de tipo epidérmico (EGF) , el péptido de activación (AP) y un dominio de proteasa de serina C-terminal con un sitio activo tripsinoide (DiScipio y col., 1978) . Esta estructura de dominio define la familia de proteasas de serina de los factores de coagulación (Furie y Furie, 1988) , incluyendo también el factor II

(F. II) , el factor VII (F. VII) , el factor X (F. X) , el factor XI (F. XI) , el factor XII (F. XII) y la proteína C (PC) . Dentro de esta familia, el F. IXa tiene unas propiedades proteolíticas únicas. La formación del complejo del F. IXa con el F. VIIIa en una superficie de fosfolípidos aumenta 106 veces la reactividad frente al sustrato natural del F. X (Duffy y Lollar, 1992) , mientras que no se observó prácticamente ninguna escisión de los péptidos con las correspondientes secuencias del F. X (McRae y col., 1981) .

El factor IX activado (F. IXa) activa entonces el factor X (F. X) en una reacción que es dependiente de la presencia de iones de calcio, una superficie de membrana (fosfolípidos) y una proteína de cofactor no enzimática, el factor VIII activado (F. VIIIa) (Davie y col., 1991) .

La importancia del F. IXa en la hemostasia está reflejada por la aparición de la alteración hemorrágica hemofilia B en individuos portadores de mutaciones en el gen del F. IX (Gianelli y col., 1998) . El F. IXa muestra sólo una pequeña actividad proteolítica frente a sustratos naturales o sintéticos en ausencia de su cofactor el F. VIIIa. La unión del F. VIIIa da como resultado un aumento de 106 veces en la actividad proteolítica para el F. X, mientras que la actividad con sustratos peptídicos permanece menos afectada (Duffy y Lollar, 1992; McRae y col., 1981) . La última actividad dependiente de sustrato de la modulación del F. IXa se observa de forma similar para las enzimas de coagulación relacionadas activadas PC (Proteína cofactor S) , F. Xa (Factor cofactor Va) , F. VIIa (factor cofactor tisular) y FIIa (cofactor trombomodulina) , que en presencia de sus cofactores, consiguen una actividad significativa o un cambio especifico con sus sustratos naturales. (Mann y col. 2003) . Todas las proteasas de serina de la coagulación comparten una amplia homología estructural y funcional.

Adicionalmente, los factores de coagulación IXa (F. IXa) y Xa (F. Xa) escinden, ambos, sustratos naturales eficazmente únicamente con un cofactor en una superficie de fosfolípidos. Hopfner y col. (1997) investigaron variantes del F. IXa (rf9a) y del F. Xa (rf10a) truncadas en E. coli para identificar determinantes de la diferencia en la actividad amidolítica del F. IXa, que es 104 veces menor que la del F. Xa. Basándose en las estructuras cristalinas del F. IXa y del F. Xa, subsiguientemente se intercambiaron cuatro componentes característicos del sitio activo (a saber Glu219, el bucle 148, Ile213, el bucle 99, basándose en la numeración de la quimotripsina) entre rf9a y rf10a. Adicionalmente, la combinación de las cuatro mutaciones introdujo esencialmente unas propiedades del F. Xa en el rf9a, es decir, la actividad amidolítica aumentó 130 veces con la selectividad de sustrato del F. Xa.

Enzimáticamente, el F. IXa se caracteriza por su muy baja actividad amidolítica, que no mejora en presencia del cofactor, el factor VIIIa (F. VIIIa) , lo que distingue al F. IXa de todos los demás factores de coagulación. La activación del complejo F. IXa-F. VIIIa requiere su sustrato macromolecular, el factor X (F. X) . El bucle 99 ubicado cerca del sitio activo justifica parcialmente la baja actividad del F. IXa debido a que adopta una conformación que interfiere con la unión del sustrato canónico en los subsitios S2 - S4. Sichler y col. (2003) desvelan que los residuos Lys-98 y Tyr99 (numeración de la quimotripsina) están críticamente relacionados con las propiedades amidolíticas del F. IXa. El intercambio de la Tyr-99 por residuos menores dio como resultado no sólo una disminución global de la actividad sino también un deterioro en la unión del S1. La sustitución de la Lys-98 por residuos menores y sin carga aumentó la actividad. La mutagénesis simultánea de Lys-98, Tyr-177 y Tyr-94 (rf9-Y94F / K98T / Y177T, numeración de la quimotripsina) ) produjo una enzima con una actividad aumentada 7.000 veces y una especificidad alterada hacia el factor Xa. Sichler y col. (2003) concluyeron que estos residuos justifican la baja actividad del factor IXa. Sichler y col. (2003) concluyeron que esta triple mutante rf9-Y94F / K98T / Y177T (numeración de la quimotripsina)

probablemente mimetiza los cambios conformacionales que son inducidos fisiológicamente por la unión del cofactor y del sustrato.

Hemofilia Los trastornos de los factores de coagulación mejor conocidos son las hemofilias. La hemofilia es el nombre de una familia de alteraciones genéticas hereditarias que deteriora la capacidad del cuerpo para controlar la coagulación de la sangre. La hemofilia A, la forma más común, está provocada por una mutación en el gen del factor VIII (F. VIII) , que produce una deficiencia en el F. VIII. La herencia es recesiva ligada a X; por lo tanto, los varones están afectados mientras que las hembras son portadoras o muy raramente muestran un fenotipo leve. 1 de cada 5.000 machos están afectados. La hemofilia B, también conocida como deficiencia del factor IX (F. IX) , es el segundo tipo de hemofilia más común, pero la hemofilia B es bastante menos común que la hemofilia A.

Estas deficiencias genéticas pueden disminuir los niveles de los factores de coagulación en el plasma sanguíneo necesarios para un proceso de coagulación normal. Cuando se lesiona un vaso sanguíneo se forma una costra temporal, pero la ausencia de los factores de coagulación impide la formación de fibrina, que es necesaria para mantener el coágulo sanguíneo. Por lo tanto, un hemofílico no sangra más intensamente que una persona normal, sino durante una cantidad mucho mayor de tiempo. En los hemofílicos graves, incluso una pequeña lesión podría dar como resultado una pérdida de sangre que durase días, semanas o que no curara nunca completamente. Aquí el riesgo crítico es con las pequeñas hemorragias normales, que debido a la ausencia del F. VIII tardan mucho tiempo en curar. En áreas tales como el cerebro o el interior de las articulaciones esto puede ser mortal o debilitante. La hemorragia con una lesión externa es normal, pero la incidencia de hemorragias de repetición tardías y de hemorragias internas aumenta, especialmente en músculos, articulaciones o hemorragias en espacios cerrados. Las principales complicaciones incluyen hemartrosis, hemorragia, hemorragia gastrointestinal y menorragia.

Aunque no existe una cura para la hemofilia, puede ser controlada con infusiones regulares del factor de coagulación deficiente, es decir, el F. VIII en la hemofilia A o el F. IX en la hemofilia B.

En los países occidentales, los estándares habituales de tratamiento para la hemofilia entran en una de estas dos categorías: (i) profilaxis o (ii) a demanda. La profilaxis implica la infusión del factor de coagulación con una programación regular con objeto de mantener los niveles de coagulación lo suficientemente altos como para evitar episodios de hemorragias espontáneas. El tratamiento a demanda implica el tratamiento de episodios hemorrágicos... [Seguir leyendo]

1. Una variante del factor IX (F. IX) o del factor IX activado (F. IXa) , que está caracterizada porque tiene actividad coagulante en ausencia de su cofactor,

en la que el cofactor es el factor VIII (F. VIII) o el factor VIII activado (F. VIIIa) ,

comprendiendo dicha variante del factor IX o del factor IX activado al menos una sustitución de aminoácido en la posición 265 en combinación con la sustitución de aminoácido V 181I.

2. La variante del factor IX de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una sustitución de aminoácido en la posición 383.

3. La variante del factor IX de la reivindicación 1 ó 2, en la que la sustitución de aminoácido en la posición 265 es seleccionada de entre K265T, K265A, K265D, K265E, K265F, K265G, K265H, K265I, K265N, K265S y K265V.

4. La variante del factor IX de la reivindicación 3, en la que la sustitución de aminoácido en la posición 265 es seleccionada de entre K265T, K265A, K265G, K265V, K265N y K265D.

5. La variante del factor IX de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que la sustitución de aminoácido en la posición 383 es I383V.

6. La variante del factor IX de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente una sustitución de aminoácido en la posición 338 y/o 377, preferiblemente que comprende adicionalmente una sustitución de aminoácido seleccionada de entre R338A, R338L y S377W.

7. La variante del factor IX de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, seleccionada de entre la variante K265T / V181I, la variante K265T / V181I / I383V, la variante K265T / V181I /I383V /R3 3 8A / S377W, la variante K265A / V181I, la variante K265A / V181I/ I383V, o la variante K265A / V181I / I383V / R338A / S377W.

8. La variante del factor IX de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 seleccionada de entre una variante con una sustitución de aminoácido en la posición 265, preferiblemente seleccionada de entre K265T, K265A, K265D, K265E, K265F, K265G, K265H, K265I, K265N, K265S y K265V, más preferiblemente seleccionada de entre K265T, K265A, K265G, K265V, K265N y K265D, en combinación con la sustitución de aminoácido V181I, preferiblemente en combinación con una sustitución de aminoácido en la posición 383, preferiblemente I383V, más preferiblemente seleccionada de entre

la variante K265T / V181I / I383V, la variante K265A / V181I / I383V, la variante K265G / VI81I / I383V, la variante K265V / V181I / I383V, la variante K265N / V181I / I383V, la variante K265D / V181I / I383V, la variante K265E / V181I / I383V, la variante K265F / V181I / 1383V, la variante K265H / V181I / I383V, la variante K265I / V181I / I383V, o la variante K265S / V181I / I383V.

9. La variante del factor IX de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende un compuesto o una fracción adicional, preferiblemente unida covalentemente a la variante.

10. La variante del factor IX de la reivindicación 9, en la que el compuesto o la fracción adicional es una proteína, un marcador y/o un polímero.

11. Un ácido nucleico que codifica para la variante del factor IX de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, preferiblemente unido operativamente a una secuencia promotora y/o de terminación,

que es más preferiblemente un plásmido de expresión, un constructo de terapia génica, un vector vírico o no vírico o un molde para la reparación génica.

12. Una composición farmacéutica que comprende al menos una variante del factor IX (F. IX) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o al menos un ácido nucleico de la reivindicación 11, y opcionalmente portador (es) y/o excipiente (s) farmacéuticamente aceptable (s) .

13. Una variante del factor IX (F. IX) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, un ácido nucleico de la reivindicación 11 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades.

14. La variante del factor IX (F. IX) , el ácido nucleico o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, en los 5 que la enfermedad es una alteración hemorrágica o una hemorragia.

15. La variante del factor IX (F. IX) , el ácido nucleico o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, en los que la alteración hemorrágica es la hemofilia A, hemofilia causada o complicada por anticuerpos inhibidores contra el factor F. VIII o el F. VIIIa, la hemofilia B, y/o en los que la alteración hemorrágica o la hemorragia es una alteración hemorrágica en la que se usan agentes de puenteo, incluyendo, por ejemplo, coagulopatías neonatales; enfermedad hepática grave; procedimientos quirúrgicos de alto riesgo; pérdida de sangre traumática; trasplante de médula ósea; trombocitopenias y alteraciones en la función plaquetar; reversión urgente de una anticoagulación oral; deficiencias congénitas en los factores V, VII, X, y XI; y enfermedad de von Willebrand con inhibidores contra el factor de von Willebrand, pérdida de sangre relacionada con grandes heridas, hemorragias cerebrales, alteraciones en las funciones de los trombocitos 16. La variante del factor IX (F. IX) , el ácido nucleico o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, para la terapia celular, la terapia génica, la terapia de infusión de proteínas.