Variantes de fitasa de Hafnia.

Método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora,

con propiedades mejoradascon respecto a la estabilidad térmica según se determina a 75° C, midiendo la actividad con respecto a la actividadmáxima, con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución,inserción o deleción y no más de 30 modificaciones en una o varias de las posiciones: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76,77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325,346, 363, 369, 396 y 403, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 deSEQ ID N.º:2. El método comprende

a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera por la cual el ADN o el gen codificanpara dicha sustitución, inserción y/o deleción,

b) conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de lafitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresiónrecombinante,

c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado,

d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y

e) recuperación de la fitasa.

Variantes de fitasa de Hafnia Referencia para el listado de secuencias [0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en soporte informático.

Campo de la invención [0002] La presente invención se refiere a una fitasa que tiene al menos 90% de identidad con una fitasa derivada de Hafnla alvei, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en el listado de secuencias anexo como SEQ ID N.º: 2 y comprende al menos una modificación tal y como se define en las reivindicaciones anexas 1 a 10 en comparación con esta fitasa (es decir, es una variante de la misma) . La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas,

constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden los polinucleótidos al igual que métodos de su producción, al igual que su uso, por ejemplo, en alimento para animales y aditivos de alimento para animales.

Antecedentes de la invención Estado de la técnica [0003] Las fitasas son enzimas bien conocidas, como lo son las ventajas de añadirlas a productos alimenticios para animales, incluidos seres humanos. Las fitasas se han aislado de muchas fuentes, incluidas varias cepas fúngicas y 25 bacterianas.

Un objeto de la presente invención es proporcionar polipéptidos alternativos con actividad de fitasa (fitasas) y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos. Las variantes de fitasa de la invención exhiben propiedades modificadas o alteradas preferiblemente mejoradas en comparación con la fitasa progenitora. Ejemplos no limitativos de tales propiedades son: estabilidad (tal como estabilidad del ácido, estabilidad térmica, estabilidad de vapor, estabilidad de granulación y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina) , perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, rendimiento en alimento para animales (tal como una liberación y/o degradación mejoradas de fitato) , susceptibilidad para glicación y/o modelo de glicosilación.

Se conocen varias estructuras tridimensionales de fitasas del tipo fosfato de ácido de histidina (HAP) . (por ejemplo, Lim et al. Nature struct. biol. 7, 108-113 (2000) . Estas fitasas están estructuralmente relacionadas, pero hay diferencias bastante grandes en las secuencias de aminoácidos.

PCT/EP2008/053561 divulga la secuencia de aminoácidos de la fitasa HAP de tipo salvaje de Hafnia alvei DSM

19197 (es decir, SEQ ID N.º:2 en la presente) , como SEQ ID N.º:10 en PCT/EP2008/053561. La estructura tridimensional de la fitasa HAP de tipo salvaje de Hafnia alvei DSM 19197 también es descrita en PCT/EP2008/053561. La estructura se corresponde correctamente con las estructuras conocidas.

Es un objeto de la invención proporcionar fitasas de propiedades modificadas, preferiblemente, mejoradas en 45 comparación con la fitasa progenitora o de referencia de las cuales éstas fueron derivadas.

Resumen del listado de secuencias [0008] En el listado de secuencias, SEQ ID N.º:1 y 2 proporcionan ADN y secuencias de aminoácidos para la fitasa de 50 Hafnia alvei DSMZ 19197.

Resumen de ejemplos [0009] En la especificación se proporcionan los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1: preparación de variantes y determinación de actividad Ejemplo 2: actividad específica Ejemplo 3: estabilidad de temperatura Ejemplo 4: termoestabilidad

Ejemplo 5: perfil de temperatura

Ejemplo 6: perfil de pH

Ejemplo 7: estabilidad de vapor

Ejemplo 8: actividad residual de glicación

Ejemplo 9: pruebas de estabilidad de granulación

Ejemplo 10: rendimiento en el alimento para animales en un modelo in vitro para pollo para consumo

Ejemplo 11: rendimiento en una prueba de cerdo in vivo Resumen de la invención [0010] La presente invención se refiere a un método para producir una variante de la fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica según se determina a 75° C, por actividad de medición con respecto a la actividad máxima, con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, caracterizada por el hecho de que dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción y no más de 30 modificaciones en unas o varias de las posiciones: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403, caracterizada por el hecho de que las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2. El método comprende a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera que por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción, b) la conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante, c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado, d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y e) recuperación de la fitasa.

El método de la invención específicamente se refiere a la producción de una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora en la cual las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones: 8L, C, M, Y; 32Q, I, L; 33C, N; 41T, Q; 54C, G; 66C; 72A; 76R, V, N; 77K, G, W, Q; 78G, R, K, Q, S, T; 93P, E, N; 95P, A; 101C; 109D, G; 111R, K, S; 131R, Q; 139C, R; 143C, V; 148R; 150C; 152A, G, T, I; 163P, K; 176C, Q, R; 179C, L, W; 187E; 201C, G, V; 207N, L, Q, R; 234L, R, C, V, E; 239R, K; 242S; 259C; 293R, K, N; 294L; 325C, K; 346S, T; 363C, R, K, V; 369S, D; 370C; 396D, E, K y 403N.

La invención así también se refiere a un método para producir una fitasa que tiene al menos 90 % de identidad con los residuos de aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2 y que comprenden al menos una modificación en al menos una posición seleccionada entre las siguientes: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403 y al menos otra modificación en al menos una posición seleccionada entre las siguientes: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403, con la condición de que la fitasa no sea la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2.

La invención también se refiere a un método para producir una fitasa que tiene al menos 90 % de identidad con los residuos de aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2 y donde las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones: 8L, C, M, Y; 32Q, I, L; 33C, N; 41T, Q; 54C, G; 66C; 72A; 76R, V, N; 77K, G, W, Q; 78G, R, K, Q, S, T; 93P, E, N; 95P, A; 101 C; 109D, G; 111R, K, S; 131R, Q; 139C, R; 143C, V; 148R; 150C; 152A, G, T, 1; 163P, K; 176C, Q, R; 179C, L, W; 187E; 201 C, G, V; 207N, L, Q, R; 234L, R, C, V, E; 239R, K; 242S; 259C; 293R, K, N; 294L; 325C, K; 346S, T; 363C, R, K, V; 369S, D; 370C; 396D, E, K y 403N.

Las variantes de fitasa producidas por la invención muestran propiedades modificadas o preferiblemente alteradas con respecto a la estabilidad térmica, caracterizadas por el hecho de que dicha estabilidad térmica según se determina a 75° C, por medición de la actividad con respecto a la actividad máxima, es superior a la estabilidad térmica de la fitasa de SEQ ID N.º:2.

La invención además se refiere a una variante de fitasa con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2 y con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica, caracterizadas por el hecho de que dicha estabilidad térmica según se determina a 75° C, por medición de la actividad con respecto a la actividad máxima, es superior a la estabilidad térmica de la fitasa de SEQ ID N.º:2 y producid por un método como se ha indicado anteriormente con la condición de que la fitasa no sea la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2.

La invención también se refiere a ADN que codifica estas fitasas, constructos de ADN, vectores de expresión y huéspedes recombinantes que comprenden estos, métodos de su producción, al igual que el uso de los mismos, por ejemplo, en el alimento para animales y aditivos de pienso alimento animales.

Descripción detallada de la invención [0017] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia progenitora, con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica según... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica según se determina a 75° C, midiendo la actividad con respecto a la actividad máxima, con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción y no más de 30 modificaciones en una o varias de las posiciones: 139, 8, 32, 33, 41, 54, 66, 72, 76, 77, 78, 93, 95, 101, 109, 111, 131, 143, 148, 150, 152, 163, 176, 179, 187, 201, 202, 234, 239, 242, 259, 293, 294, 325, 346, 363, 369, 396 y 403, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2. El método comprende

a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción, b) conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante, c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado, d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y e) recuperación de la fitasa.

2. Método según la reivindicación 1, donde las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones: 8L, C, M, Y; 32Q, I, L; 33C, N; 41T, Q; 54C, G; 66C; 72A; 76R, V, N; 77K, G, W, Q; 78G, R, K, Q, S, T; 93P, E, N; 95P, A; 101C; 109D, G; 111R, K, S; 131R, Q; 139C, R; 143C, V; 148R; 150C; 152A, G, T, I; 163P, K; 176C, Q, R; 179C, L, W; 187E; 201C, G, V; 207N, L, Q, R; 234L, R, C, V, E; 239R, K; 242S; 259C; 293R, K, N; 294L; 325C, K; 346S, T; 363C, R, K, V; 369S, D; 370C; 396D, E, K y 403N.

3. Variante de fitasa con al menos 90% de identidad con SEQ ID N.º:2 y con propiedades mejoradas con respecto a la estabilidad térmica donde dicha estabilidad térmica según se determiina a 75º C, midiendo la actividad con respecto a la actividad máxima, es superior a la estabilidad térmica de la fitasa de SEQ ID N.1º:2 y producida según la reivindicación 1 o 2 con la condición de que la fitasa no es la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2

4. Fitasa según la reivindicación 3, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: 8C; 33C; 54C; 66C; 101C; 139C; 143C; 201C; 150C; 176C; 179C; 259C; 325C; 363C y 370C.

5. Fitasa según la reivindicación 4, que comprende al menos un conjuntos de modificaciones seleccionado de las siguientes: 139C/201C; 33C/179C; 35C/172C; 36C/177C; 36C/176C; 143C/201C; 54C/101C; 66C/370C y 150C/259C.

6. Fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: 93P y 5P.

7. Fitasa de cualquiera de las reivindicaciones 3-6 que es una variante de la fitasa de SEQ ID N.º:2.

8. Fitasa según la reivindicación 7, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: F8C; D33C; E54C; E66C; A101C; K139C; H143C; I201C; A150C; K176C; Y179C; L259C; G325C; H363C; y L370C.

9. Fitasa según la reivindicación 8, que comprende al menos un consunto de modificaciones seleccionadas de las siguientes: K139C/I201C; Y179C/D33C; L172C/T35C; S177C/P36C; K176C/P36C; H143C/I201C; E54C/A101C; E66C/L370C y A150C/L259C.

10. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: Q93P y K95P.

11. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 7-10 con las modificaciones: V130L/M137L/V146I/I201V/M260L/I266V/E54C/A101C/K207Q, D33C/E54C/A101C/Y179C E54C/A101C/K139C/I201C/K207Q, E54C/A101C/K139C/I201C, S 1 QGPS/K26H/E54C/A101C/K139C/Q162N/G186S/I1201C/K207Q/G346S, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/K207Q/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, T35A/Y48H/E54C/P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H3 63R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I1201C/V208T/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R,

E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/H363R, E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, P75N/K76N/D77Q/N78T/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R,

Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Q9S/N78Q/A89A/D92Y/H115M/A132V/K139C/Q162R/Q181L/I201C/A217G/K234V/P348R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152I/I201C/A217G/K234V/N247D/H363R, D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R,

D92Y/E100W/K139C/D173N/P175S/I201C/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/V208T/A217G/K234V/N247D/Q256D/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R, Y48H/D92Y/E100W/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/Q256D/H363R,

Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247D/R289W/H363R, Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R y Y48H/E54C/D92Y/A101C/K139C/T152A/I201C/A217G/K234V/N247W/R289W/H363R.

12. Secuencia de ácidos nucleicos aislados que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fitasa 20 según cualquiera de las reivindicaciones 3-11.

13. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 12 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado.

14. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 13.

15. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 13 y/o el

vector de expresión según la reivindicación 14. 30

16. Composición que comprende al menos una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-11 y

(a) al menos una vitamina fitosoluble;

(b) al menos una vitamina soluble en agua y/o

(c) y/o al menos un oligoelemento. 35

17. Composición según la reivindicación 16 que comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o betaglucanasa.

18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 16-17 que es un aditivo de pienso.

19. Método para producir un producto de fermentación, que comprende (a) fermentación usando un microorganismo fermentador de un material que contiene carbohidrato en presencia de una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-11 y (b) producción del producto de fermentación o coproducto de fermentación del material que 45 contiene carbohidrato fermentado.

20. Método según la reivindicación 19, carecterizado por el hecho de que el producto de fermentación es etanol, cerveza, vino, o granos secos de destilería (DDG) .