Variantes de factor VIII optimizadas mediante codones y promotor sintético específico para el hígado.

Una molécula de ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y que codifica factor VIII funcional

Variantes de factor VIII optimizadas mediante codones y promotor sintético específico para el hígado

Campo de la invención La invención se refiere a una secuencia codificadora optimizada de factor ocho (VIII) de coagulación sanguínea humana. Además, la invención se refiera a vectores como rAAV para la introducción de la secuencia de factor VIII optimizado en células para llevar a cabo su expresión. La invención se refiere también a células transformadas con estos vectores, animales transgénicamente modificados que contienen células modificadas usando los vectores y usos terapéuticos que utilizan los vectores en una propuesta de sustitución génica.

Antecedentes de la invención Los inventores están interesados en el desarrollo de una estrategia de transferencia génica segura y eficaz para el tratamiento de la hemofilia A (HA) , el trastorno sanguíneo heredado más común. Esto representaría un avance clínico considerable con implicaciones significativas para otros trastornos congénitos que carecen de tratamiento eficaz. Los inventores ya han desarrollado una propuesta alentadora de terapia génica para la hemofilia B usando vectores virales recombinantes adeno-asociados (rAAV) . La hemofilia A plantea varios retos nuevos debido a las propiedades moleculares y bioquímicas distintas del factor VIII humano (hFVIII) , una molécula que es mutada en esta enfermedad. Estas incluyen el tamaño relativamente grande del hFVIII cDNA y el hecho de que la expresión de proteínas de hFVIII es altamente ineficaz. Los inventores han comenzado a abordar algunas de estas limitaciones a través de avances de la tecnología de vectores y el desarrollo de una variante de hFVIII nueva más potente (codophFVIII) que puede ser eficazmente envasada en rAAV.

La hemofilia A (HA) es un trastorno sanguíneo conectado a x que afecta aproximadamente a uno de cada uno 5.000 varones, que está provocada por mutaciones en el gen de factor VIII (FVIII) , que codifica un cofactor esencial en la cascada de coagulación. Los pacientes de HA grave (>50% de los pacientes) tienen menos de 1% de la actividad normal de FVIII y adolescen de hemorragias espontáneas en articulaciones que soportan peso y tejidos blandos, que provocan una incapacidad permanente y ocasionalmente la muerte. El patrón habitual para el cuidado de la HA consiste en concentrados de proteína de hFVIII recombinante, que puede detener la hemorragia pero que no evita el deterioro crónico que surge después de una hemorragia. La administración profiláctica de concentrados de factor para mantener los niveles de FVIII en plasma por encima de 1% (>2 ng/ml) conduce a una reducción considerable de la hemorragia espontánea y la artropatía crónica. Sin embargo, la semivida del FVIII es corta (8-12 horas)

necesitando tres administraciones intravenosas de concentrados por semana. Esto es prohibitivamente caro (>100 mil libras esterlinas/año/paciente) , es altamente invasiva y requiere tiempo. Debido al coste y el suministro limitado, por encima de un 75% de los pacientes de HA grave no reciben ningún tratamiento o solamente exporádicos con concentrados de FVIII. Estos individuos se enfrentan a una vida enormemente acortada con dolor e incapacidad.

Por lo tanto, se ha prestado atención a una terapia génica somática para HA debido a su capacidad potencial para una curación a través de la producción endógena continua de FVIII a continuación de una administración única de vector. La hemofilia A está de hecho bien adecuada para una propuesta de sustitución génica porque sus manifestaciones clínicas son completamente atribuibles a la falta de un producto de gen único (FVIII) y circula en cantidades diminutas (200 ng/ml) en el plasma. No es esencial un control estrictamente regulada de la expresión 45 génica y un aumento modesto en el nivel de FVIII (>1% del normal) puede mejorar el fenotipo grave. La disponibilidad de modelos animales que incluyen ratones desprovistos de FVIII y perros con hemofilia A puede facilitar una evaluación preclínica extensiva de estrategias de terapias génicas. Finalmente, las consecuencias de la transferencia de genes puede ser valorada usando una cuantificación simple en lugar de puntos finales cualitativos, que puede ser fácilmente ensayada en la mayoría de los laboratorios clínicos, lo que contrasta con otros objetivos de terapias génicas en los que la expresión es difícil de valorar o está influenciada por factores adicionales como el flujo de sustrato.

Han sido realizado tres ensayos de fase I de transferencia génica hasta ahora para la HA usando un suministro de genes in vivo directo de vectores onco-retro-o adeno-virales así como un trasplante autólogo de fibroblastos 55 autólogos modificados mediante plásmidos. No se consiguió la expresión estable de hFVIII por encima de 1%. Estos estudios preclínicos y los posteriores resaltaron los obstáculos biológicos críticos graves para una terapia génica satisfactoria de la HA.

El tratamiento celular de la molécula de FVIII de longitud completa de tipo salvaje es altamente complejo y la expresión se confunde con la inestabilidad de mRNA, la interacción con acompañantes del retículo endoplásmico (ER) , y una necesidad de un transporte facilitado desde el ER hasta el aparato de Golgi a través de una interacción con lectina LMAN1 de unión a manosa. Sin embargo, han sido desarrolladas variantes de FVIII más potentes y nuevas a través de avances progresivos en la comprensión de la biología de la expresión de FVIII. Por ejemplo, los estudios bioquímicos demostraron que el dominio B de FVIII era suministrable para la actividad del cofactor VIII. La 65 supresión del dominio B dio lugar a un aumento de 17 veces en los niveles de mRNA sobre el FVIII de tipo salvaje y de longitud completa y un aumento de 30% en la proteína secretada. Esto condujo al desarrollo de concentrado de proteína FVIII desprovista de dominio B (BDD) , que es ampliamente usada en la actualidad en el campo clínico. Sin embargo, unos estudios recientes indican que el hFVIII de longitud completa y BDD se pliegan mal en el Lumen del ER, dando lugar a la activación de la respuesta de proteínas no plegadas (UPR) y la apoptosis de hepatocitos de múridos. Sin embargo, la adición de un separador de dominios B corto, con elevado contenido de oligosacáridos conectados a asparagina, a BDD-FVIII (=N6-FVIII) resuelve este problema en parte a través de un transporte mejorado desde el ER hasta el aparato de Golgi. El N6-FVIII es secretado a niveles 100 veces superiores al FVIII de tipo salvaje y de longitud completa, pero los inventores creen que la secreción de FVIII puede ser mejorada adicionalmente a través de la modificación del genoma de FVIII.

El rAAV muestra habitualmente las mejores previsiones para los trastornos crónicos como la HA debido a su excelente perfil de seguridad. Además, los inventores y otros han mostrado que una administración única de vector rAAV es suficiente para dirigir la expresión transgénica a largo plazo sin una toxicidad significativa en una diversidad de modelos animales que incluyen primates no humanos. La integración del provirus rAAV ha sido descrita, pero a una frecuencia que es excesivamente baja y comparable a la del DNA de plásmido. Por lo tanto, la expresión transgénica estable está mediada principalmente por genomas de rAAV episomalmente retenidos en los tejidos postmitóticos, reduciendo así el riesgo de una oncogénesis insercional. Esto contrasta con los vectores integrantes que se ha mostrado que provocan un trastorno linfoproliferativo en niños con SCID-XI. Aunque recientemente se ha informado de resultados alentadores en pacientes que sufren enfermedad de Parkinson y amaurosis congénita de Lever a continuación de una transferencia génica mediada por rAAV, hasta recientemente el tamaño grande del

hFVIII c de NA (-7 Kb) , que sobrepasa la capacidad de envasado relativamente pequeña de rAAV de ~ 4, 7 a 4, 9 Kb, a limitado el uso de este vector para la HA. Un informe reciente de Pierce y colaboradores demostró la expresión a largo plazo (>4 años) de FVIII canino con supresión de dominio B (BDD) a un 2, 5-5% de lo normal a continuación de una administración única de rAAV en perros con hemofilia A. Sin embargo, la expresión mediada por rAAV de FVIII humano no ha sido establecida hasta el mismo grado.

Actualmente, la complicación más grave y comprometedora del tratamiento con concentrados de FVIII es el desarrollo de anticuerpos neutralizantes para FVIII (inhibidores de FVIII) que se produce en hasta un 30% de pacientes con HA. Estos inhibidores anulan los efectos biológicos de los concentrados de FVIII y hacen que sea difícil tratar episodios de hemorragias, excepto con agentes de derivación como factor VII... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácidos nucleicos aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 90% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y que codifica factor VIII funcional.

2. La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 1, que tiene una identidad de al menos 95% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

3. La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que codifica una proteína que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 21 que tiene entre 0 y 10 cambios de aminoácidos para la misma.

4. La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 3, que codifica una proteína que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 21.

5. La molécula de ácidos nucleicos de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de nucleótidos seleccionada entre la secuencia de la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 7.

6. La molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende adicionalmente una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos 85% respecto a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 3.

7. Un vector, que comprende una molécula de ácidos nucleicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Una célula hospedante que comprende la molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el vector de la reivindicación 7.

9. Un animal transgénico que comprenden células que comprenden la molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el vector de la reivindicación 7.

10. La molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un vector según la reivindicación 7, para ser usada en terapia.

11. Una molécula de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un vector según la reivindicación 7, para ser usados en el tratamiento de hemofilia.

12. Un método para la preparación de un vector de suministro de genes parvovirales, comprendiendo el método las etapas de

(a) proporcionar una célula de insecto que comprende uno o más constructos de ácidos nucleicos que comprenden:

(i) una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que está flanqueada por al menos una secuencia de nucleótidos repetida, terminal, invertida y parvoviral;

(ii) un primer cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas Rep parvovirales que está funcionalmente conectado a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la (s) proteína (s) Rep en la célula de insecto;

(iii) un segundo cassette de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas de cápsides parvovirales que está funcionalmente conectado a un promotor que es capaz de conducir la expresión de la (s) proteína (s) de la cápside en la célula de insecto;

(b) cultivar la célula de insecto definida en el apartado (a) bajo condiciones que conduzcan a la expresión de las proteínas Rep y de la cápside; y, opcionalmente,

(c) recuperar el vector de suministro de genes parvovirales.