USO DE UNA COMBINACIÓN DE AZATIOPRINA Y L-BUTIONINA-[S,R]-SULFOXIMINA EN LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO ÚTIL PARA EL TRATAMIENTO DE UN TUMOR REFRACTARIO.

La presente invención describe el uso de una combinación de azatioprina (AZA) y L-butionina-[S,

R]-sulfoximina (BSO), o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de un tumor refractario, preferiblemente cáncer. La combinación de la invención se ha mostrado como especialmente eficiente respecto de la técnica en particular en el tratamiento de tumores sólidos de hígado, de colon y de metástasis de colon en el hígado, tumores que presentan gran resistencia a la quimioterapia. La invención también protege la composición farmacéutica en la que se presenta la combinación y el kit que contiene dicha composición.

Uso de una combinación de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de un tumor refractario

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe la combinación sinérgica de azatioprina (AZA) y L-butionina-[S, R]-sulfoximina (BSO) para uso en terapia combinada para el tratamiento y/o quimiosensibilización de tumores refractarios a la quimioterapia convencional. Se encuadra dentro del tratamiento del cáncer por quimioterapia, en el campo de la biomedicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La familia de fármacos conocida como tiopurinas está constituida por el profármaco azatioprina (AZA) , 6mercaptopurina (6-MP) y 6-tioguanina (6-TG) . Las dos últimas, 6-MP y 6-TG, se utilizan en el tratamiento de leucemias, mientras que la AZA no está indicada para leucemias y sí se utiliza en el tratamiento de enfermedades autoinmunes como el síndrome de Crohn, colitis ulcerosa, hepatitis autoinmune o esclerosis múltiple entre otras, y también para evitar rechazos en el transplante de órganos.

A pesar de la actividad antineoplásica de 6-MP y 6-TG no se han utilizado en el tratamiento de tumores sólidos de hígado, de colon y de metástasis de colon en el hígado, debido entre otros factores a la resistencia de dichos tumores a la quimioterapia.

La transformación de la AZA en 6-MP se lleva a cabo por un mecanismo dependiente de glutation (GSH) , en el que participa un grupo de enzimas muy heterogéneo desde el punto de vista molecular, pero que tienen todas ellas en común la capacidad de incorporar al sustrato un resto de glutation; por ello se denominan glutation-S-transferasas (GSTs) . Las isoformas más activas de las GSTs implicadas en la biotransformación de la AZA son muy abundantes en el hígado y en el colon humano y se inducen en el proceso tumoral (Ruzza P et al. “Glutathione transferases as targets for cancer therapy”. Anticancer Agents Med Chem. 2009, Vol. 9 (7) , pág 763-777) . En el cáncer de mama se ha observado que la actividad de las enzimas GSTs está relacionada con la agresividad del cáncer, con la evolución de la enfermedad, y con la respuesta al tratamiento (Bugano DD et al. “Genetic polymorfisms, the metabolism of estrogens and breast cancer: a review”. Eur J Gynaecol Oncol. 2008, Vol. 29 (4) , pág 313-320) . Por ello se han desarrollado diferentes métodos para identificar polimorfismos de la familia de las GSTs, su relación con el desarrollo de la enfermedad y con la eficacia del tratamiento (EP 1999278 A2) . Asimismo, se han desarrollado inhibidores de las GSTs que permiten evitar la resistencia a agentes quimio-terapéuticos para tratar el cáncer (EP 1865942 A2) .

Las GSTs son enzimas bisustrato que reconocen a la AZA y al glutation (GSH) y transfieren el GSH al anillo imidazolio de la AZA, liberando 6-MP. Como continuación del proceso, la 6-MP se incorpora al conjunto de nucleótidos gracias a la enzima hipoxantin guanosin fosforribosil transferasa (HGPRT) dando lugar a tioinosin monofosfato (6-TIMP) , el cual tras dos etapas enzimáticas, da lugar a 6-tioguanosin monofosfato (6-TGMP) . Dicho nucleótido es inactivo al estar defosforilado, por lo que tras dos etapas de fosforilación se obtiene 6-tioguanosín trifosfato (6-TGTP) nucleótido activo capaz de inhibir rac (proteína G pequeña) dando lugar a la apoptosis del linfocito T activado por CD28. (Tiede I et al. " CD28-dependent Rac1 activation is the molecular target of azathioprine in primar y human CD4+ T lymphocytes". J Clin Invest. 2003, Vol. 111 (8) , pág. 1133-1145) . Es por lo tanto la molécula de 6-TGTP la que presenta la capacidad de bloquear el proceso patológico en las enfermedades autoinmunes.

Por otro lado, el nucleótido 6-TGMP (6-tioguanosín monofosfato) formado en la anterior ruta metabólica puede ser transformado por la ribonucleótido reductasa (RR) en desoxi-6-TGMP, que da lugar al nucleótido desoxi-6-TGTP tras dos etapas de fosforilación.

Los nucleótidos 6-TGTP y desoxi-6-TGTP se pueden incorporar al ARN y al ADN respectivamente de las células que se están dividiendo activamente, como por ejemplo de los linfoblastos de los pacientes con leucemia (Coulthard SA et al. "The effect of thiopurine methyltransferase expression on sensitivity to thiopurine drugs". Mol Pharmacol. 2002, Vol. 2 (1) , pág 102-109) . Como consecuencia se forma ARN mensajero y ADN aberrante que dan lugar a mutaciones puntuales y a aberraciones cromosómicas que conducen a la muerte celular por mecanismos dependientes de p53 y del sistema de reparación de ADN conocido como MMR (mismatch repair system) (Zeng X et al. "DNA mismatch repair initiates 6-thioguanine-induced autophagy through p53 activation in human tumor cells". Clin Cancer Res. 2007, Vol. 13 (4) , pág. 1315-1321) . Esta última vía es la responsable de los efectos terapéuticos en el tratamiento de la leucemia, pero también de efectos adversos graves como la mielotoxicidad en pacientes con enfermedades autoinmunes tratados con tiopurinas (Gisbert JP et al. " Thiopurine methyltransferase (TPMT) activity and adverse effects of azathioprine in inflammator y bowel disease: long-term follow-up study of 394 patients". Am J Gastroenterol. 2006, Vol. 101 (12) , pág. 2769-2776) o con otras patologías. El número de leucocitos circulantes depende de la

rápida proliferación de sus precursores celulares en la médula ósea, por lo que un aumento exagerado de 6-TGTP y de desoxi-6-TGTP pueden dar lugar a citotoxicidad de los precursores medulares y por lo tanto a mielotoxicidad. La aparición de dicho efecto adverso se ha relacionados con los niveles de tiopurin metiltransferasa (TPMT) , enzima que incorpora grupos metilo sobre la el azufre de las tiopurinas y por lo tanto da lugar a moléculas con menor actividad farmacológica. La disminución de la actividad de la TPMT aumenta la probabilidad de padecer mielotoxicidad al ser tratado con AZA (Gisbert JP et al. "Thiopurine methyltransferase (TPMT) activity and adverse effects of azathioprine in inflammator y bowel disease: long-term follow-up study of 394 patients". Am J Gastroenterol. 2006, Vol. 101 (12) , pág. 2769-2776) .

Además existe un porcentaje de pacientes (3-5%) que presentan hepatotoxicidad al ser tratados con AZA, lo que se ha relacionado con la reducción de los niveles de glutation (GSH) . Estos datos se han confirmado en estudios llevados a cabo in vitro utilizando hepatocitos normales de rata en cultivo, cuyo tratamiento con AZA da lugar a necrosis, procesos que se revierte con un precursor del glutation como N-acetilcisteína (Menor C et al. "Azathioprine acts upon rat hepatocyte mitochondria and stress-activated protein kinases leading to necrosis: protective role of Nacetyl-L-cysteine". J Pharmacol Exp Ther. 2004, vol. 311 (2) , pág. 668-676) . En dicho modelo experimental el BSO, un inhibidor de la síntesis de glutation, favorece los efectos tóxicos de la AZA sobre los hepatocitos de rata en cultivo (Lee AU et al. “Mechanism of azathioprine-induced injur y to hepatocytes: roles of glutathione depletion and mitochondrial injur y ”. Journal of hepatology, 2001, Vol. 35 (6) , pág. 756-764) . Esta publicación examina el efecto citotóxico de la combinación de una dosis única de cada compuesto, por lo que es imposible saber si hay un fenómeno de sinergia o tal solo de aditividad. En el estudio se demuestra que una de las líneas tumorales utilizadas son resistentes a los efectos de la AZA; en concreto, las células HepG2 procedentes de un hepatoblastoma humano muestran un comportamiento completamente diferente a los hepatocitos de rata en cultivo, resultando insensibles tanto a la AZA como a la 6-MP (Lee AU et al. “Mechanism of azathioprine-induced injur y to hepatocytes: roles of glutathione depletion and mitochondrial injur y ”. Journal of hepatology, 2001, Vol. 35 (6) , pág. 756-764) .

Aunque la asociación de AZA y BSO conduce a una mayor toxicidad que la de ambos fármacos por separado en cultivos de hepatocitos normales de rata, resulta imprevisible el efecto de AZA y BSO sobre las células tumorales de hígado y de colon resistentes a la quimioterapia convencional. Para probar dicho efecto los inventores han estudiado el efecto de la combinación de ambas moléculas sobre células tumorales procedentes de hígado, en concreto HepG2, HuH7 y células Chang de hígado (Tsang JY et al. "P-glycoprotein enhances radiation-induced apoptotic cell death through the regulation of miR-16 and Bcl-2 expressions in hepatocellular carcinoma cells”. Apoptosis 2011, Vol. 16 (5) , pág 524-535; Hoffmann K et al. “Sorafenib modulates the gene expression of multi-drug resistance mediating ATP-binding cassette proteins in experimental hepatocellular carcinoma”. Anticancer Res 2010,...

1. Uso de una combinación de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina, o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de un tumor refractario.

2. Uso según la reivindicación 1, en que dicho tumor refractario es un cáncer.

3. Uso según la reivindicación 2, en que dicho cáncer es un blastoma.

4. Uso según la reivindicación 3, en que dicho blastoma es un hepatoblastoma

5. Uso según la reivindicación 2, en que dicho cáncer es un carcinoma.

6. Uso según la reivindicación 5, en que dicho carcinoma es un carcinoma hepático.

7. Uso según la reivindicación 5, en que dicho carcinoma es un carcinoma de colon.

8. Uso según la reivindicación 2, en que dicho cáncer es una metástasis de un carcinoma de colon.

9. Uso según la reivindicación 2, en que dicho cáncer es una metástasis de un cáncer primario de hígado.

10. Uso de una combinación de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina, o sus sales farmacéuticamente aceptables, para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de un tumor refractario, donde dicha combinación se usa en terapia combinada con un agente anticancerígeno.

11. Uso de azatioprina o sus sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento contra un tumor refractario, donde dicho medicamento se usa en terapia combinada con L-butionina[S, R]-sulfoximina o sus sales farmacéuticamente aceptables.

12. Uso de L-butionina-[S, R]-sulfoximina o sus sales farmacéuticamente aceptables en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento contra un tumor refractario, donde dicho medicamento se usa en terapia combinada con azatioprina o sus sales farmacéuticamente aceptables.

13. Combinación de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina, o sus sales farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento de un tumor refractario.

14. Una combinación según la reivindicación 13, en que dicho tumor refractario es un cáncer.

15. Una combinación según la reivindicación 14, en que dicho cáncer es un blastoma.

16. Una combinación según la reivindicación 15, en que dicho blastoma es un hepatoblastoma.

17. Una combinación según la reivindicación 14, en que dicho cáncer es un carcinoma.

18. Una combinación según la reivindicación 17, en que dicho carcinoma es un carcinoma hepático.

19. Una combinación según la reivindicación 17, en que dicho carcinoma es un carcinoma de colon.

20. Una combinación según la reivindicación 14, en que dicho cáncer es una metástasis de un carcinoma de colon.

21. Una combinación según la reivindicación 14, en que dicho cáncer es una metástasis de un cáncer primario de hígado.

22. Combinación de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina, o sus sales farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento contra un tumor refractario, donde dicha combinación se usa en terapia combinada con un agente anticancerígeno.

23. Azatioprina o sus sales farmacéuticamente aceptables para el tratamiento contra un tumor refractario en terapia combinada con L-butionina-[S, R]-sulfoximina, o sus sales farmacéuticamente aceptables.

24. L-butionina-[S, R]-sulfoximina o sus sales farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento contra un tumor refractario en terapia combinada con azatioprina o sus sales farmacéuticamente aceptables.

25. Composición farmacéutica que comprende la combinación de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina, o sus sales farmacéuticamente aceptables, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.

26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 25, para el tratamiento de un tumor refractario en un sujeto.

27. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 25 ó 26, que se administra en el tracto gastrointestinal de un sujeto.

28. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 25 ó 26, que se administra por vía endovenosa o por vía peritumoral.

29. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizada por que dicha composición es una emulsión.

30. Una composición farmacéutica según la reivindicación 29, caracterizada por que dicha emulsión es una efusión grasa.

31. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizada por que dicho sujeto es un mamífero.

32. Una composición farmacéutica según la reivindicación 31, caracterizada por que dicho mamífero es un paciente humano.

33. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, caracterizada por que la administración de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina se realiza de forma simultánea.

34. Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, caracterizada por que la administración de azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina se realiza de forma separada o secuencial.

35. Kit que incluye contenedores separados que contienen al menos dos formulaciones farmacéuticas que comprenden azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina conjuntamente o por separado, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables e instrucciones para el uso de uno de esos componentes en conjunción con el otro componente.

36. Kit que comprende azatioprina y L-butionina-[S, R]-sulfoximina aptos para su administración simultánea, separada o secuencial para el tratamiento de un tumor gastrointestinal en un sujeto.

37. Un kit según las reivindicaciones 35 ó 36, en que dicho sujeto es un paciente humano.

OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

N.O solicitud: 201131315 22 Fecha de presentación de la solicitud: 29.07.2011 32 Fecha de prioridad:

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A KIRKPATRICK D L. Modification of antitumor disulfide cytotoxicity by glutathione depletion in 1-37

murine cells. Cancer research. 15.08.1987. ISSN 0008-5472 (Print) . VOL 47 (16) . Pag. 4391 -

4395. Todo el document.

x LEE A U ; FARRELL G C. Mechanism of azathioprine-induced injur y to hepatocytes: roles of 13-24

glutathione depletion and mitochondrial injur y . Journal of hepatology. Dic. 2001. ISSN 0168-8278

(Print) . VOL 35 (6) . Pag. 756 - 764. Figura 3, pagina 759, ap.3.2.

A ARRICK B A; NATHAN C F. Glutathione metabolism as a determinant of therapeutic efficacy: 1-37

a review. Cancer research, Oct. 1984. ISSN 0008-5472 (Print) . VOL 44 (10) . Pag. 4224 - 4232.

Pagina 4229, tabla 1.

Categoria de los documentos citados x: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nO:

Fecha de realización del informe 20.04.2012 Examinador M. A. Martin-Falquina Garre Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TºCNICA

NO de solicitud: 201131315

CLASIFICACIºN OBJETO DE LA SOLICITUD A61K31/52 (2006.01)

A61K31/198 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) Documentación minima buscada (sistema de clasificación seguido de los simbolos de clasificación)

A61K, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la bºsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de bºsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, ºPI, BIOSIS, EMBASE, MEDLINE, NPL, xPESP

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/5

OPINIÓN ESCRITA

NO de solicitud: 201131315

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 20.04.2012

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-12.

2. 37 Reivindicaciones 13-24 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-12.

2. 37 Reivindicaciones 13-24 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Consideraciones:

Los documentos de la solicitud de patente sobre los que se basa esta Opinión Escrita son el resultado de las modificaciones efectuadas durante el proceso de examen formal y tecnico de la solicitud de patente.

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OPINIÓN ESCRITA

NO de solicitud: 201131315

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionanlos documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01 KIRKPATRICK D L. Modification of antitumor disulfide cytotoxicity by glutathione depletion in murine cells. Cancer research. 15.08.1987. ISSN 0008-5472 (Print) . VOL 47 (16) . Pag. 4391 4395. Todo el documento 15.08.1987

D02 LEE A U; FARRELL G C. Mechanism of azathioprine-induced injur y to hepatocytes: roles of glutathione depletion and mitochondrial injur y . Journal of hepatology. Dic. 2001. ISSN 01688278 (Print) . VOL 35 (6) . Pag. 756 -764. Figura 3, pagina 759, ap.3.2 00.12.2001

D03 ARRICK B A; NA THAN C F . G lutathione m etabolism as a determinant of t herapeutic efficacy: a r eview. Cancer r esearch, Oct. 1984. ISSN 00 08-5472 (Print) . VOL 44 ( 10) . Pag. 4224 4232. Pagina 4229, tabla 1 00.10.1984

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración Reivindicación 1: El documento D01 se considera el estado de la tecnica mas cercano en relación con la reivindicación 1. Divulga el uso de Lbutionina-R-S-sulfoximina (BSO) en combinación con derivados de 6-mercaptopurina con el fin de incrementar la toxicidad de estos ºltimos en celulas tumorales murinas EMT6 resistentes a quimioterapia (ver pagina 4391, columna 2, parrafo 3 y figura 2) . Sin embargo, este documento no se refiere concretamente a azatioprina (AºA) por lo que la reivindicación 1 cumple el requisito de novedad segºn el art. 6 de la Ley 11/1986. Ademas, de acuerdo con lo que menciona D01 en la pagina 4392, columna 2, parrafo 2, no todos los derivados de 6-mercaptopurina ensayados responden al tratamiento con BSO con un incremento de la actividad antitumoral. Por lo tanto, no existe en D01ninguna sugerencia que induzca al experto en la materia a utilizar una combinación de AºA y BSO en el sentido de la reivindicación 1 y tambien cumple el requisito de actividad inventiva segºn el art. 8 de la Ley 11/1986. El documento D03 plantea que puedan producirse in vivo interacciones terapeuticas (sinergias o reversión de resistencias) cuando se combina BSO con otros agentes antineoplasicos, AºA entre otros (ver tabla 1 y pagina 4229, col 2) . Sin embargo, no puede considerarse que el uso de la combinación AºA y BSO en terapia contra tumores refractarios este especificamente divulgado ni que los efectos a que se refiere la invención sean previsibles para el experto en la materia a partir de D03. En consecuencia, la reivindicación 1 tambien es nueva e inventiva en relación con D03.

Reivindicaciones 2-10, 11 y 12: Las reivindicaciones 2-10, en tanto que son dependientes de la reivindicación 1, tambien satisfacen los requisitos de novedad y actividad inventiva (arts. 6 y 8, Ley11/1986) , asi como las reivindicaciones 11 y 12 a las que se aplica el mismo razonamiento utilizado en el caso de la reivindicación 1.

Reivindicaciones 13-24: Las reivindicaciones 13 a 24 se han interpretado en el sentido que establecen las Directrices de Examen de Solicitudes de Patente de la O EPM ( pag. 150 -151) co mo r eivindicaciones de pr oducto º adecuado p ara...º. E n co nsecuencia, la combinación de AºA y BSO de las reivindicaciones 13 a 22 se considera anticipada por D02 (ver figura 3 y apartado 3.2 en la pagina 759) . Segºn el mismo razonamiento, las reivindicaciones 23 y 24 tambien estan anticipadas por D02 y no cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva (arts. 6 y 8, Ley11/1986) .

Reivindicacione.

2. 34: Ninguno de los documentos del estado de la tecnica disponible divulga la composición farmaceutica a que se refieren las reivindicacione.

2. 34. La combinación BSO-AºA divulgada en D02 no se encuentra en forma de composición farmaceutica ya q ue s us efectos se prueba º in v itroº. Por ot ra parte, D 03 si m enciona l a p osibilidad de qu e la m anipulación d el metabolismo de glutation mediante BSO podria producir efectos sinergicos en terapia combinada con otros antitumorales y cita AºA entre otros. Sin embargo, se trata de una hip6tesis planteada por los autores que no aporta suficiente información como para que un experto en la materia considere la realización de una composición farmaceutica de ambos compuestos tal y como lo hacen las reivindicacione.

2. 34. Por lo tanto dichas reivindicacione.

2. 34 cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva (arts. 6 y 8, Ley11/1986) .

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OPINIÓN ESCRITA

NO de solicitud: 201131315

Reivindicacione.

3. 37: Ninguno de los documentos del estado de latecnica disponible divulga ni siquierainsinºaun ºit como el reivindicado en las reivindicaciones 35 a 37, por lo tanto dichas reivindicaciones cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva (arts. 6 y 8, LP11/1986) .

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