Uso de oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión de Akt-1.

Un compuesto de oligonucleótido que tiene una secuencia que comprende SEC ID Nº 2,

Nº 4, Nº 16 o Nº 17,elegido como diana para una molécula de ácido nucleico que codifica Akt-1 humana, en el cual el compuesto deoligonucleótido inhibe la expresión de Akt-1 humana.

Uso de oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión de Akt-1

Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos compuestos de oligonucleótidos antisentido, RX-0194, RX-0201, RX0616, RX-0627, RX-0628, RX-0632 y RX-0638, que inhiben la expresión de una proteína humana, Akt-1, y también inducen citotoxicidad en varias líneas de células cancerosas.

Antecedentes de la invención La proteína Akt-1 es una proteína de señalización que es producida en cantidades elevadas por varios tipos de células cancerosas humanas. Se cree que esta proteína participa, entre otras cosas, en un complejo proceso que transmite una señal de supervivencia a células bajo estrés, que puede permitir la supervivencia preferencial de células tumorales ayudándolas a evitar la progresión normal a apoptosis, o muerte celular. Esta proteína también participa en la transmisión de señales de control relacionadas con importantes funciones fisiológicas, tales como metabolismo de la insulina y síntesis de proteínas, además de diversos aspectos de crecimiento y diferenciación celular, que incluyen el crecimiento de plaquetas, células de la piel y fibroblastos. La alteración de la proteína Akt-1 puede tener un efecto pleiotrópico. Es decir, la mutación de la proteína puede producir múltiples efectos, aparentemente sin relacionar, dentro de las células de un animal. Estos efectos indican la importancia de Akt-1, y su posible utilidad en el tratamiento de enfermedad, siempre que pueda obtenerse la precisión apropiada en uso. Así, el objetivo aquí es inhibir la producción de Akt-1 en el contexto adecuado, es decir, cuando envía una señal de supervivencia no deseable a células cancerosas.

Akt-1 ejerce su efecto mediante un proceso conocido generalmente como señalización de células. La señalización de células es un mecanismo, o ruta biológica, que regula el crecimiento y la supervivencia celular. Diversos productos químicos producidos por el cuerpo, tales como factores de crecimiento y citocinas, sirven de señales extracelulares que interaccionan con la membrana de una célula. La membrana propaga las señales al interior de la célula, manifestándose diversos efectos biológicos. Una ruta de señalización se activa cuando una molécula de señalización externa, o ligando, se une a la membrana celular, y una proteína cinasa o una fosfatasa modifica una proteína diana en una localización específica sobre la molécula. Las proteínas cinasas son enzimas que (junto con otros materiales tales como fosfatasas) regulan la propagación de las señales extracelulares al interior de la célula. Las proteínas cinasas sirven para fosforilar proteínas en localizaciones específicas, concretamente en residuos de serina, treonina y tirosina. Como resultado, las cinasas se clasifican por su sitio de fosforilación específica. Akt-1 (por tanto, “PKB alfa y RAC-PK alfa”) es un miembro de la familia AKT/PKB de serina/treonina cinasas. En muchas rutas de señalización pueden participar varias etapas usando diferentes cinasas. Una cinasa “aguas arriba” puede fosforilar, o activar, una proteína “diana aguas abajo”, que a su vez puede ser una cinasa que tiene varias dianas. Frecuentemente se encuentra que las rutas de propagación de señales de células están alteradas en cáncer y otras afecciones de enfermedad. Tales cambios pueden indicar que esta ruta de señalización se afecta cuando las células pierden su mecanismo de señalización normal.

Por ejemplo, la actividad de tirosina cinasas, o señalización, se vuelve hiperactiva en las fases tempranas del desarrollo de cáncer, u oncogénesis. Una consecuencia de esta elevada actividad es un aumento de la actividad por otra cinasa, la PI 3 cinasa. Se sabe que la PI 3 cinasa activa varios miembros de la familia AKT/PKB, y se han observado niveles elevados de AKT/PKB en cánceres de mama u otros cánceres. En un estudio reciente, la función de Akt era el único factor que se encontró que se afectaba por un gen supresor de tumores alterado, PTEN, en moscas de la fruta (Stocker y col., Science, 2002, 295: 2088) .

Debido a su efecto pleiotrópico sobre, es decir, su importancia para, muchas rutas metabólicas en la célula, Akt-1 se ha estudiado ampliamente como fármaco diana para cáncer y diabetes. Los inhibidores de cinasas aguas arriba para Akt-1 han sido el principal centro en el desarrollo de fármacos que podrían cambiar la función de Akt-1. Sin embargo, este enfoque todavía no había demostrado ser suficientemente específico, debido a que los inhibidores generalmente eran tóxicos para células.

Otras estrategias que tuvieron como objetivo inhibir la función de Akt-1 han implicado el uso de diversos inhibidores para las cinasas aguas arriba inmediatamente responsables de fosforilar Akt-1. Sin embargo, estas estrategias no son específicas para Akt-1, y también se alteraron otras proteínas importantes.

Se ha propuesto otro enfoque, concretamente usar oligonucleótidos antisentido, para modificar pequeñas porciones del gen que controla la expresión, o producción de, Akt-1.

La patente US 5.958.773 concedida a Monia y col., 28 de septiembre de 1999, se refiere al uso de diversos oligonucleótidos antisentido para la modulación de la expresión de ácidos nucleicos que codifican Akt-1. Los resultados se informan en términos de inhibición de la producción de Akt-1. Los oligonucleótidos específicos desvelados y reivindicados en la presente invención no se desvelaron en esa patente.

Breve descripción de los dibujos Fig. 1. Análisis por RT-PCR de la inhibición de Akt-1 por diversos oligonucleótidos Fig. 2. RX-0194 inhibe la expresión de ARNm de Akt-1 en diversas células cancerosas Fig. 3. RX-0201 inhibe la expresión de ARNm de Akt-1 en diversas células cancerosas Fig. 4. Análisis de transferencia Western de inhibición de la expresión de proteínas Akt-1 por RX-0194 y RX-0201

Fig. 5. Pruebas de citotoxicidad de diversos oligonucleótidos en células UMRC2

Fig. 6. RX-0194 produce citotoxicidad celular en diversas células cancerosas Fig. 7. RX-0201 produce citotoxicidad celular en diversas células cancerosas Fig. 8A. RX-0201 produce pérdida de peso del tumor en ratones sin pelo implantados con células de glioblastoma de cerebro humano U251.

Fig. 8B. RX-0201 produce pérdida de peso del tumor en ratones sin pelo implantados con células de adenocarcinoma de próstata humano PC-3.

Fig. 9A. RX-0201 prolonga la tasa de supervivencia al tumor en ratones sin pelo implantados con células de carcinoma renal humano Caki-1.

Fig. 9B. RX-0201 prolonga la tasa de supervivencia al tumor en ratones sin pelo implantados con células de adenocarcinoma de próstata humano PC-3.

Fig. 9C. RT-0201 prolonga la tasa de supervivencia al tumor en ratones sin pelo implantados con células de carcinoma pancreático humano PANC-1.

Descripción resumida de la invención La presente invención se refiere a oligonucleótidos antisentido que son elegidos como diana para un ácido nucleico que codifica Akt-1, y que modulan la expresión de Akt-1. También se proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de Akt-1 en células que comprende poner en contacto las células con los compuestos y composiciones de oligonucleótidos de la invención. Una ventaja de los oligonucleótidos presentemente descritos es que, además de inhibir la expresión de Akt-1, tienen un efecto citotóxico sobre varias líneas de células cancerosas diferentes. Las ventajas de la presente invención pueden obtenerse poniendo en contacto células de diversas líneas de células cancerosas con un compuesto antisentido que es específicamente hibridable con un sitio en el gen Akt-1 que tiene la siguiente secuencia: 5' agtggactggtgggggctgg 3' en el sitio 1.271 del gen Akt-1 (Genbank nº BC000479) (SEC ID Nº 1) . Particularmente se prefiere RX-0194, que comprende 5' ccagcccccaocagtccact 3' (SEC ID Nº 2) . Pueden obtenerse ventajas similares con un compuesto que es antisentido para la secuencia 5' cgccaaggagatcatgcagc 3' en el sitio 1.478 del gen Akt-1 (Genbank nº BC000479) (SEC ID Nº 3) . Particularmente se prefiere RX-0201, que comprende 5' gctgcatgatctccttggcg 3' (SEC ID Nº 4) . El contacto se produce en condiciones que permiten que el oligonucleótido se hibride con el gen que codifica Akt-1. Después de la hibridación, la capacidad de las células para producir Akt-1 se inhibe, y se reduce la viabilidad de células de cáncer. Además de los 2 oligonucleótidos anteriores, en la presente invención se describen 5 compuestos de oligonucleótidos antisentido adicionales que también regularon por disminución la expresión de ARNm de Akt-1 y produjeron efectos citotóxicos sobre líneas de células... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de oligonucleótido que tiene una secuencia que comprende SEC ID Nº 2, Nº 4, Nº 16 o Nº 17, elegido como diana para una molécula de ácido nucleico que codifica Akt-1 humana, en el cual el compuesto de oligonucleótido inhibe la expresión de Akt-1 humana.

2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el compuesto es un oligonucleótido antisentido.

3. El oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 2 que tiene al menos un enlace internucleosídico modificado que es un enlace fosforotioato.

4. Un procedimiento para tratar células humanas o tejidos in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con el compuesto de la reivindicación 1.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 en el cual se inhibe la expresión de Akt-1.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 en el cual se induce citotoxicidad.

7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de tratamiento médico de un ser humano o animal por terapia.

8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de tratamiento médico de un 15 ser humano o animal por terapia, en el cual en el procedimiento se inhibe la expresión de Akt-1.

9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de cáncer.

10. Uso de un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en la fabricación de una composición para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer en un animal o ser humano.

Fig. 1. Análisis por RT-PCR de la inhibición de Akt-1 por diversos oligonucleótidos Fig. 2. RX-0194 inhibe la expresión de ARNm de Akt-1 en diversas líneas de células cancerosas (C: control, S: RX-0194) Fig. 3. RX-0201 inhibe la expresión de ARNm de Akt-1 en diversas líneas de células cancerosas (C: control, S: RX-0201)

Fig. 4. Análisis de transferencia Western de la inhibición de la expresión de proteína Akt-1 por RX-0194 y RX-0201 Fig. 5. Prueba de citotoxicidad de diversos oligonucleótidos en células UMRC2 Fig. 6. RX-0194 provoca toxicidad celular en diversas células cancerosas Fig. 7. RX-0201 provoca toxicidad celular en diversas células cancerosas Fig. 8A. RX-0201 provoca pérdida de peso del tumor en ratones desnudos implantados con células de glioblastoma cerebral humano U251 Fig. 8B. RX-0201 provoca pérdida de peso del tumor en ratones desnudos implantados con células de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 Fig. 9A. RX-0201 prolonga la tasa de supervivencia al tumor en ratones desnudos implantados con células de carcinoma renal humano Caki-1 Fig. 9B. RX-0201 prolonga la tasa de supervivencia al tumor en ratones desnudos implantados con células de adenocarcinoma de próstata humano PC-3 Fig. 9C. RX-0201 prolonga la tasa de supervivencia al tumor en ratones desnudos implantados con células de carcinoma pancreático humano PANC-1