Uso de agentes moduladores de la conversión de priones.

Uso de apolipoproteína B en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra.

Uso de agentes moduladores de la conversión de priones Campo de la invención Esta invención se refiere al uso de la apolipoproteína B o apolipoproteína E o fragmentos o miméticos de la misma para el diagnóstico, la detección, el pronóstico y la identificación de moduladores de la replicación de la proteína priónica. Más específicamente, la invención proporciona el uso de moduladores de la apolipoproteína B o fragmentos de la misma para modular la replicación de la proteína priónica que está implicada en la patogénesis de encefalopatías espongiformes transmisibles y otras enfermedades priónicas.

Antecedentes de la invención La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) en seres humanos y la tembladera y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en animales son algunas de las enfermedades que pertenecen al grupo de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) , también conocidas como enfermedades priónicas (Prusiner, 1991) . Estas enfermedades se caracterizan por un periodo de incubación extremadamente largo, seguido de una patología clínica breve e invariablemente fatal (Roos y col., 1973) . Hasta la fecha no existe tratamiento.

Aunque estas enfermedades son relativamente raras en los seres humanos, el riesgo de transmisibilidad de la EEB a los seres humanos a través de la cadena alimentaria ha llamado la atención de las autoridades de salud pública y de la comunidad científica (Soto y col., 2001) . La ECJ variante (ECJv) es una nueva enfermedad, descrita por primera vez en marzo de 1996 (Will y col., 1996) . A diferencia de los casos típicos de ECJ esporádica (ECJe) , esta forma variante afecta a pacientes jóvenes (edad media 27 años) y presenta un curso relativamente largo de la enfermedad (promedio de 14 meses frente a 4, 5 meses en la ECJ tradicional) . La primera hipótesis que se planteó fue que podía existir una relación entre la ECJv y la EEB debido a la coincidencia de estas dos EET en espacio y tiempo (Bruce, 2000) . Las evidencias más recientes y convincentes provienen de estudios que muestran que las características de transmisión de la EEB y la ECJv a ratones son siempre idénticas, indicando claramente que se deben al mismo agente causante (Bruce y col., 1997) . Además, se ha demostrado ahora que los ratones transgénicos que portan un gen humano o bovino son susceptibles a la EEB y la ECJv (Scott y col., 1999) . Tampoco se ha propuesto ninguna otra hipótesis plausible para la aparición de la ECJv, y la intensa vigilancia de la ECJ en cinco países europeos con una baja exposición al agente de la EEB no ha identificado casos adicionales. En conclusión, la causa más probable de la ECJv es la exposición al agente de la EEB, probablemente por contaminación de la dieta con tejido afectado del sistema nervioso central bovino.

La naturaleza del agente transmisible ha sido objeto de una apasionada controversia. Investigaciones adicionales han indicado que el agente de las EET difiere significativamente de los virus y otros agentes convencionales en que no parece contener ácidos nucleicos (Prusiner, 1998) . Además, los procedimientos fisicoquímicos que inactivan la mayoría de los virus, como la alteración de ácidos nucleicos, han resultado ineficaces para reducir la infectividad del patógeno de las EET. Por el contrario, se ha descubierto que los procedimientos que degradan proteínas inactivan el patógeno (Prusiner, 1991) . Por consiguiente, la teoría que propone que el agente transmisible no es un virus ni otro agente infeccioso previamente conocido, sino un agente no convencional formado únicamente por una proteína, cuenta recientemente con una amplia aceptación (Prusiner, 1998) . Esta nueva clase de patógenos se denominó "prión", que es la abreviatura para "partícula proteica infecciosa" (proteinaceous infectious particle) . En las EET los priones se componen principalmente de una proteína mal plegada denominada PrPSc (por "scrapie" PrP) , que es una versión modificada después de la traducción de una proteína normal llamada PrPC (Cohen y col., 1998) . No se han detectado diferencias químicas que distingan a estas dos isoformas de la PrP, y la conversión parece implicar un cambio conformacional por medio del cual disminuye el contenido de hélices a en la proteína normal y aumenta la cantidad de hojas 1 (Pan y col., 1993) . Los cambios estructurales preceden a alteraciones en las propiedades bioquímicas: la PrPC es soluble en detergentes no desnaturalizantes, la PrPSc es insoluble; la PrPC es digerida fácilmente por proteasas (denominada también proteína priónica sensible a proteasas) mientras que la PrPSc es parcialmente resistente, dando lugar a la formación de un fragmento truncado en el extremo N-terminal, conocido como PrPres (proteína priónica resistente a proteasas) (Cohen y col., 1998) .

Experimentos en los que se silenció el gen endógeno de la PrP cuando los animales eran tanto resistentes a la enfermedad priónica como incapaces de generar nuevas partículas infecciosas apoyan la idea de que la PrPC endógena está involucrada en el desarrollo de la infección (Bueler y col., 1993) . Además, está claro que en el tiempo transcurrido entre la inoculación con la proteína infecciosa y la aparición de los síntomas clínicos se produce un drástico aumento en la cantidad de PrPSc.

Estos hallazgos sugieren que la PrPC endógena adquiere la conformación de la PrPSc por acción de una forma infecciosa de la molécula PrP (Soto y col., 2001) . Se supone que los priones se replican cuando la PrPSc del inóculo infeccioso interactúa específicamente con la PrPC del hospedador, catalizando su conversión en la forma patógena de la proteína. La especificidad por la secuencia primaria en la transmisión de priones (Telling y col., 1994) y la generación in vitro de moléculas similares a la PrPSc al mezclar PrPC purificada con PrPSc (Saborio y col., 2001) sugieren la existencia de una asociación física entre las dos isoformas durante el proceso infeccioso. Sin embargo, no se conoce el mecanismo exacto subyacente a la conversión.

Las investigaciones con transgenes quiméricos han demostrado que es probable que la PrPC y la PrPSc interactúen en un dominio central delimitado por los codones 96 y 169 (Prusiner, 1996) , y se ha probado que péptidos sintéticos de la PrP que abarcan la región 109-141 son capaces de unirse a la PrPC y de competir con la interacción de la PrPSc (Chabr y y col., 1998) .

En base a los datos obtenidos con animales transgénicos se ha propuesto que para la propagación de los priones son esenciales otros factores cerebrales adicionales presentes en el hospedador (Telling y col., 1995) . Se ha demostrado previamente que la conversión de los priones no se produce en condiciones experimentales cuando se mezclan e incuban PrPC purificada y PrPSc (Saborio y col., 1999) , pero que la actividad de conversión se recupera cuando se vuelven a añadir las demás proteínas celulares a la muestra (Saborio y col., 1999) . Este hallazgo proporciona evidencias directas de que son esenciales otros factores presentes en el cerebro para catalizar la propagación de los priones.

La observación de que la reducción de colesterol reduce la formación de PrPSc mientras que la reducción de esfingolípidos aumenta la formación de PrPSc ha sugerido que las "balsas lipídicas" (dominios lipídicos en las membranas que contienen esfingolípidos y colesterol) pueden ser el lugar de la reacción de conversión de PrPC en PrPSc, que implica bien una proteína asociada a las balsas o bien lípidos seleccionados de las balsas (Fantini y col., 2002) . Sin embargo, el papel de las balsas lipídicas en la infectividad de los priones sigue sin estar claro.

Se han desarrollado varios métodos de detección de priones in vitro en una muestra. El conjunto de métodos de detección conocidos incluye métodos de detección de la PrPSc mediante portadores de ligandos específicos seleccionados entre aminoglucanos, fibronectina y apolipoproteína A (documento WO 02/065133) ; métodos en los que se usan los anticuerpos monoclonales seleccionados entre Gö138, 3B5 y 12F10 (Schulz y col., 2000) ; métodos basados en la formación de un complejo entre la PrPSc y la apolipoproteína H (documento WO 03/005037) ; o métodos basados en la amplificación de PrPSc in vitro denominada amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA, por sus siglas en inglés) , descrita en Saborio y col., 2001 y Lucassen y col., 2003.

La apolipoproteína B es el componente proteico principal de las dos lipoproteínas aterogénicas conocidas, las lipoproteínas de baja densidad (LDL, por sus siglas en inglés) y los remanentes de lipoproteínas ricas en triglicéridos. Se considera que la concentración de apolipoproteína B refleja directamente el número de... [Seguir leyendo]

1. Uso de apolipoproteína B en un ensayo para la detección de la formación de PrPSc en una muestra.

2. Uso de apolipoproteína B en un ensayo de cribado para la identificación de compuestos que modulan la conversión de PrPC en PrPSc.

3. Uso según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la apolipoproteína B forma un complejo con el receptor de LDL.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) .

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) en el que se usa homogenado cerebral normal como fuente de PrPC normal y sustrato.

6. Uso según las reivindicaciones de la 1 a la 5, en el que el ensayo es un ensayo de amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (PMCA) en el que se usan balsas lipídicas de la línea celular de neuroblastoma N2a sensible a infección como fuente de PrPC normal y sustrato.

7. Uso de un anticuerpo producido contra la apolipoproteína B para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad priónica.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad priónica es la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) .

9. Uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad priónica es la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) .

10. Método para el diagnóstico o la detección de una enfermedad priónica en un sujeto que se sospecha sufre una enfermedad de este tipo, que comprende (i) poner una muestra de dicho sujeto en contacto con apolipoproteína B;

(ii) poner la muestra obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

11. Método para la determinación de un marcador que predisponga a un sujeto a una enfermedad priónica, que comprende (i) medir el nivel de apolipoproteína B en una muestra; y (ii) correlacionar dicho nivel de proteína obtenido en dicha etapa de medición con la presencia de una enfermedad priónica.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, en el que la enfermedad priónica es la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) .

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 11, en el que la enfermedad priónica es la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

14. Método para la detección de PrSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B; (ii) poner la muestra obtenida en (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPc; y

(iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

15. Método para identificar en una muestra un compuesto que modula la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B (a) en presencia de dicho compuesto modulador y (b) en ausencia de dicho compuesto; (ii) poner las mezclas obtenidas en las etapas (i) a y (i) b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto modulador y (b) en ausencia de dicho compuesto modulador.

16. Método para la detección de PrSc en una muestra, comprendiendo el ensayo (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B; (ii) poner la mezcla obtenida en la etapa (i) en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la presencia y/o cantidad de PrPSc en dicha muestra.

17. Ensayo de cribado para identificar un compuesto que modula la transición de PrPC a PrPSc, que comprende: (i) poner dicha muestra en contacto con apolipoproteína B (a) en presencia de dicho compuesto modulador y (b) en ausencia de dicho compuesto modulador; (ii) poner las mezclas obtenidas en las etapas (i) a y (i) b en contacto con PrPC o mezclas que contienen PrPC; y (iii) determinar la cantidad de PrPSc (a) en presencia de dicho compuesto y

(b) en ausencia de dicho compuesto modulador.

Figura 7