Un método y una ordenación para soportar verticalmente elementos de resistencia eléctrica pendientes.

Un método para modular la resistencia de una célula bacteriana frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción de un bacteriófago del mismo que comprende las etapas de:

(i) identificar uno o más seudo espaciadores CRISPR en un genoma de bacteriófago que sea capaz de proporcionar resistencia al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo;

(ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprenda un gen casI y al menos dos repeticiones CRISPR junto con dichos uno o más seudo espaciadores CRISPR identificados; e

(iii) introducir dicho ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana para así volver a la célula bacteriana resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

Un método y una ordenación para soportar verticalmente elementos de resistencia eléctrica pendientes Campo de la invención La presente invención se refiere a la modulación entre otras de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo. En particular, la presente invención se refiere, en un aspecto, al uso de uno o más genes cas o proteínas para la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mimo.

Antecedentes de la invención Cultivos, tales como los cultivos iniciadores (“starter”) , se usan ampliamente en la industria alimenticia en la producción de productos fermentados incluyendo los productos de leche (tales como yogurt, mantequilla y queso) , productos cárnicos, productos de panadería, vino y productos vegetales. La preparación de cultivos es labor intensa, que ocupa mucho espacio y equipamiento, y hay un riesgo considerable de contaminación con bacteria de degradación y/o fagos durante la etapa de propagación. El fracaso de los cultivos bacterianos por infección de bacteriófago (fago) y multiplicación es un problema muy importante con el uso industrial de cultivos bacterianos. Hay muchos tipos diferentes de fagos con mecanismos variantes para atacar las bacterias. Además, aparecen nuevas cepas de bacteriófagos.

Las estrategias usadas en la industria para minimizar la infección de bacteriófago, y así el fracaso de un cultivo bacteriano, incluyen el uso de: (i) cultivos iniciadores mezclados; y (ii) el uso alterno de cepas que tienen diferentes perfiles de susceptibilidad a fago (rotación de cepa) .

(i) Tradicionalmente, los cultivos iniciadores en la industria láctea son mezclas de cepas bacterianas de ácido láctico. La composición compleja de los cultivos iniciadores mezclados asegura que está presente un cierto nivel de resistencia a ataque de fago. Sin embargo, el sub cultivo repetido de cultivos de cepa mezclada conduce a cambios impredecibles en la distribución de cepas individuales y finalmente dominancia de cepa indeseada. Esto por turnos puede conducir a susceptibilidad incrementada a ataque de fago y riesgo de fracasos de fermentación.

(ii) La rotación de cepas bacterianas seleccionadas que son sensibles a diferentes fagos es otro enfoque para limitar el desarrollo del fago. Sin embargo, es difícil y engorroso identificar y seleccionar un número suficiente de cepas que tengan perfiles de diferente tipo de fago para proporcionar un programa de rotación eficiente y fiable. Además, el uso continuo de cepas requiere realizar un cuidadoso seguimiento de los nuevos fagos infecciosos y la necesidad de sustituir rápidamente una cepa que está infectada por el nuevo bacteriófago por una cepa resistente. En la producción de plantas donde grandes cantidades de cultivos iniciadores a granel

(“bulk starter”) se realizan con anticipación, normalmente no es posible dicha respuesta rápida.

Se han realizado varios intentos para mejorar la resistencia de los cultivos para usar en la industria.

Pedersen et al. (“7th symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications”, 1-5 de Septiembre, 2002, Egmond aan Zee, Países Bajos) enseña una cepa de Lactococcus lactis resistente a fago, la cual tiene no actividad timidilato sintasa y la cual requiere timidina durante la replicación del ADN.

El documento WO 01/14520 describe una bacteria de ácido láctico que tiene una susceptibilidad reducida hacia el ataque por al menos un tipo de bacteriófago. Dichas bacterias de ácido láctico comprenden un gen mutado implicado en el metabolismo de pirimidina, principalmente pyrG que da como resultado un defecto en la CTP sintetasa.

Kosuge et al. (1998-“Appl. Environ. Microbiol”, Volumen: 64, Ejemplar: 11, Página (s) : 4.328-4.332) y Kosuge et al (1994-FEMS “Microbiology Letters”, 123 (1/2) 55-62) enseña una bacteria Thermus thermophilus HB27 que está mutada en el gen proB y es incapaz de utilizar prolina para el crecimiento.

Bolotin et al. “Microbiology” 2005, Vol. 151, p2.551-2.569 enseña que numerosos genomas procariotas contienen estructuras conocidas como CRISPRS.

Jansen et al. “Molecular MIcrobiology” 2002, Vol. 43, Nº 6, p1.565-1.575 usó análisis in silico para estudiar una familia novedosa de secuencias de ADN repetitivas (CRISPR) en procariotas.

Sin embargo, hay una continua necesidad de mejorar los cultivos para usar en la industria.

Compendio de la invención

En la presente memoria se describe el uso de los loci CRISPR o un componente de los mismos para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

CRISPRs (del Inglés “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” “Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Agrupadas”) (también denominadas SPIDRs- del Inglés “Spacer Interspersed Direct Repeats”, “Repeticiones directas intercaladas de Espaciador”) constituyen una familia de loci de ADN

recientemente descritos. Los loci CRISPR consisten en repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (generalmente de 24 a 40 pb, repetidas entre 1 y 140 veces) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (normalmente específicas a una especie) están interespaciadas por secuencias variables de longitud constante (generalmente de 20 a 58 pb dependiendo de CRISPR) . Hasta 20 loci CRISPR distintos se han encontrado dentro de un cromosoma sencillo.

Aunque la función biológica de los loci CRISPR es desconocida se han propuesto algunas hipótesis. Por ejemplo, se ha propuesto que pueden estar implicados en el acoplamiento del cromosoma a una estructura celular, o en la replicación del cromosoma y partición del replicón (Jansen et al., 2002; Pourcel et al., 2005) . Además, Mojica et al. 2005 plantea la hipótesis de que CRISPR podría estar implicada en conferir inmunidad específica frente a ADN exógeno y Pourcel et al. (2005) plantea la hipótesis de que CRISPRs son estructuras que son capaces de absorber piezas de ADN exógeno como parte de un mecanismo de defensa. Bolotin et al. (2005) sugiere que los elementos espaciador de CRISPR son las trazas de invasiones pasadas por elementos extracromosómicas, y plantea la hipótesis de que proporcionan una célula con inmunidad frente a infección de fago, y más generalmente expresión de ADN exógeno, mediante la codificación de un ARN anti-sentido. Bolotin et al. (2005) también sugiere que los genes cas son necesarios para la formación de CRISPR.

Al contrario de las enseñanzas de la técnica anterior que plantean la hipótesis de que CRISPR o los espaciadores CRISPR podrían estar implicados en conferir inmunidad específica, la presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los genes cas o proteínas son requeridos para la inmunidad frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Incluso más sorprendentemente, los inventores han descubierto que uno o más genes cas o proteínas están asociados con dos o más repeticiones CRISPR dentro de los loci CRISPR. En otras palabras, los genes cas o proteínas parecen ser específicos para una repetición CRISPR de ADN dado, que quiere decir que los genes cas o proteínas y la secuencia repetida forman un par funcional. Por consiguiente, se pueden usar uno o más espaciadores CRISPR junto con uno o más de estos pares funcionales (es decir, repeticiones CRISPR y genes cas) para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico o un producto de transcripción del mismo.

En una realización, para que uno o más espaciadores CRISPR confieran inmunidad a la célula, la (s) repetición (es) CRISPR y el (los) gen (es) cas o proteínas forma (n) una combinación funcional, es decir, la (s) repetición (es) y el (los) gen (es) cas o proteínas son compatible (s) .

Por consiguiente, en la presente memoria sugerimos por primera vez que un gen cas o proteína influye resistencia, tal como la resistencia de una bacteria a uno o más bacteriófagos. En particular, el conocimiento de dos o más repeticiones CRISPR y/o uno o más genes cas o proteínas para una célula dada será una ventaja para predecir, determinar y modificar su resistencia, por ejemplo, su lisotipo, el cual define la resistencia/sensibilidad de una bacteria dada a diversos bacteriófagos. Por lo tanto, la identificación y la detección de loci CRISPR en, por ejemplo, células y bacteriófagos podría ayudar a determinar, predecir y modificar el perfil de resistencia de una célula o... [Seguir leyendo]

1. Un método para modular la resistencia de una célula bacteriana frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción de un bacteriófago del mismo que comprende las etapas de:

(i) identificar uno o más seudo espaciadores CRISPR en un genoma de bacteriófago que sea capaz de proporcionar resistencia al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo;

(ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprenda un gen casI y al menos dos repeticiones CRISPR junto con dichos uno o más seudo espaciadores CRISPR identificados; e

(iii) introducir dicho ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana para así volver a la célula bacteriana resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico diana en el bacteriófago es una secuencia de ácido nucleico altamente conservada.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó reivindicación 2, en el que el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica un proteína de especificidad a hospedante.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una proteína que es esencial para la supervivencia, la replicación o el crecimiento del bacteriófago.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una helicasa, una primasa, una proteína estructural de cabeza o cola, una proteína con un dominio conservado (por ejemplo, holin, lisina y otras) o una secuencia conservada entre genes importantes de fago.

6. Una célula obtenida u obtenible mediante un método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. El uso de una célula de acuerdo con la reivindicación 6, para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

8. Un cultivo celular que comprende una célula de acuerdo con la reivindicación 6, para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

9. El cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho cultivo es un cultivo iniciador o un cultivo probiótico.

10. Un producto alimenticio o comida que comprende el cultivo de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9.

11. Un proceso para preparar un producto alimenticio o comida que comprende el uso del cultivo de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9.

12. El uso del cultivo de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 para preparar un producto alimenticio.