Un método de cribado para compuestos que reducen el estrés del RE.

Una célula de levadura que comprende un elemento sensor del estrés del retículo endoplasmático (RE)ligado operablemente a un elemento indicador y que comprende un gen exógeno que codifica una proteína queinduce el estrés del RE,

donde el elemento sensor del estrés del RE es una secuencia de ADN del elemento derespuesta a la proteína desplegada KAR2.

Un método de cribado para compuestos que reducen el estrés del RE

La presente invención se refiere a una célula de levadura que comprende un elemento de estrés del retículo endoplasmático (RE) ligado operablemente a un elemento indicador y un gen exógeno que codifica una proteína que induce el estrés del RE, donde el elemento de estrés del RE es una secuencia de ADN del elemento de respuesta a la proteína desplegada KAR2. Los métodos de cribado que utilizan la célula modificada y los métodos para producir la célula también forman parte de la invención.

La función biológica de células y, en última instancia, de tejidos, órganos y cuerpo, depende del plegamiento correcto de un sistema de miles de proteínas. La secuencia aminoacídica de una proteína dada contiene la información requerida para plegarla en una estructura tridimensional específica y funcional. En células sanas, las proteínas se pliegan adecuadamente en su conformación natural y, si no lo hacen, las proteínas chaperonas deben corregir el plegamiento incorrecto (Bukau B, Weissman J, Horwich A. Cell. 2006; 125 (3) :443-51) . En los trastornos debidos al plegamiento incorrecto de las proteínas (PMD, por sus siglas en inglés) o los trastornos conformacionales (CD, por sus siglas en inglés) , sin embargo, el plegamiento incorrecto de un proteína da como resultado su degradación (p. ej., fibrosis quística) o su agregación y acumulación en forma de depósitos proteicos cerca del sitio de su producción celular o en diversos tejidos (Soto C, Estrada LD. Arch Neurol. 2008;65 (2) :184-9; Winklhofer KF, Tatzelt J, Haass C. EMBO J. 2008;27 (2) :336-49; Gregersen N. J Inherit Metab Dis. 2006;29 (2-3) :456-70) .

Hay ciertos mecanismos que son comunes a la gran mayoría de las enfermedades conformacionales proteicas que incluyen la formación de agregados, regulación transcripcional alterada, disfunción mitocondrial, inducción del estrés del RE y deficiencia del sistema ubiquitina-proteasoma. La inducción del estrés del RE es uno de los mecanismos más comunes asociados con las enfermedades conformacionales proteicas (Yoshida H. FEBS J. 2007; 274 (3) :63058) .

El RE es un importante compartimento de plegamiento proteico en la célula eucariota, tan solo superado por el citosol. El plegamiento proteico en el RE es más complejo que el plegamiento proteico en el citosol porque las proteínas se modifican postraduccionalmente. El plegamiento en el RE debe acoplar las rutas de síntesis proteica que operan fuera del compartimento con las rutas de plegamiento asistidas por el RE (ERAF, por sus siglas en inglés) en el lumen. La expresión de una versión mutante de una proteína o incluso algunas proteínas naturales, infección vírica, agotamiento de nutrientes o energía, condiciones ambientales extremas o estímulos que provocan una liberación excesiva del calcio del lumen de RE comprometen las reacciones de plegamiento proteico en el RE, lo que da lugar a la acumulación de las proteínas desplegadas e inicio de una cascada de señales que se transmiten al citoplasma y núcleo. Cuando la demanda de plegamiento proteico en el RE excede la capacidad de plegamiento del RE, se produce una condición denominada “estrés del RE” (Malhotra JD, Kaufman RJ. Semin Cell Dev Biol. 2007; 18 (6) :716-31) . El estrés del RE también puede ser el resultado de otras condiciones, concretamente cuando una proteína que se traduce en el citosol se pliega de manera incorrecta e induce el reclutamiento de la maquinaria de plegamiento, lo que lleva a un déficit de asistencia en el plegamiento en el RE.

Los desequilibrios en el plegamiento mediado por chaperonas que están asociados con numerosas enfermedades debidas al plegamiento incorrecto (incluidas diabetes, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, encefalopatías priónicas, fibrosis quística y muchas otras) desencadenan la respuesta a proteínas desplegadas (UPR, por sus siglas en inglés) , utilizando tanto las rutas transcripcionales como las traduccionales para corregir el problema y aliviar el estrés del RE. Esta respuesta adaptativa incluye los siguientes pasos: 1) la activación transcripcional de genes que codifican chaperonas que residen en el RE y catalizadores de plegamiento; 2) complejos de degradación proteica que aumentan la capacidad de plegamiento del RE y 3) la atenuación traduccional para evitar una acumulación mayor de proteínas desplegadas en el RE. Las moléculas de bajo peso molecular moduladoras de las rutas de respuesta al plegamiento proporcionan nuevas herramientas farmacológicas para ajustar estos desequilibrios. La reprogramación de las rutas de estrés con fármacos proporciona una nueva estrategia potencial para equilibrar la cantidad de proteína del RE con la capacidad de plegamiento celular y de este modo se corrige la enfermedad subyacente.

Existen algunos métodos de cribado para identificar moduladores del estrés del RE, tales como los descritos en el documento WO2005/034737, el cual describe un cribado en mamíferos que implica la utilización del componente dependiente de inositol 1 (IRE1) y/o la proteína 1 de unión a la caja X (XBP-1) como marcadores específicos del estrés del RE. Sin embargo, estos cribados no suponen un sistema sensible, económico y de producción rápida para identificar moduladores del estrés del RE.

Dado que hay una necesidad urgente de agentes terapéuticos con el potencial de prevenir y/o tratar enfermedades relacionadas con el estrés del RE, hay una gran demanda de un método de cribado de producción rápida que mantenga la sensibilidad.

La presente invención proporciona una plataforma de cribado celular de este tipo, sensible, rápida y económica para compuestos que serán útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con el estrés del RE.

La invención es tal y como se expone en las reivindicaciones.

El primer aspecto de la invención proporciona una célula de levadura que comprende un elemento sensor del estrés del RE ligado operablemente a un elemento indicador y que comprende un gen exógeno que codifica una proteína que induce el estrés del RE, donde el elemento sensor del estrés del RE es una secuencia de ADN del elemento de respuesta a la proteína desplegada KAR2.

En una realización, la célula es una célula de Saccharomyces cerevisiae o de cualquier otra cepa de levadura del orden de los Saccharomycetales.

El elemento KAR2 UPRE de la invención puede comprender i) la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO:1, una secuencia nucleica que sea homóloga a esta en más del 95% o a su ADN complementario o secuencia correspondiente de ARN, una variante, fragmento o la hebra complementaria a esta o ii) una secuencia de ácido nucleico, especialmente ADN o ARN, que se hibride con la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:1, una secuencia de ácido nucleico que sea homóloga a esta en más del 95% o una variante o fragmento de esta.

Este aspecto de la invención se extiende al elemento KAR2 UPRE que comprende una secuencia de ácido nucleico que es homóloga en al menos el 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de ADN de la SEQ ID NO:1 o a su ADN complementario o una secuencia correspondiente de RNA.

La hibridación puede tener lugar en condiciones sumamente rigurosas. Tal como se definen en la presente, las condiciones “sumamente rigurosas”, pueden identificarse como aquellas que: (1) emplean una baja fuerza iónica y una temperatura elevada para lavar, por ejemplo, cloruro sódico 0, 015 M/citrato sódico 0, 0015 M/dodecilsulfato sódico al 0, 1% a 50 ºC; (2) emplean un agente desnaturalizante durante la hibridación, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0, 1% (p/v) /Ficol al 0, 1% (p/v) /polivinilpirrolidona al 0, 1% (p/v) /tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6, 5 con cloruro sódico 750 mM y citrato sódico 75 mM a 42 ºC.; o (3) emplean formamida al 50% (v/v) , 5xSSC (NaCl 0, 75 M, citrato sódico 0, 075 M) , fosfato sódico 50 mM (pH 6, 8) , pirofosfato sódico al 0, 1%, 5x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 μg/mL) , SDS al 0, 1% (p/v) y sulfato de dextrano al 10% (p/v) a 42 ºC, con lavados a 42 ºC en 0, 2xSSC (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55 ºC, seguidos de un lavado sumamente riguroso que consiste en 0, 1xSSC que contiene EDTA a 55 ºC.

El porcentaje de identidad de las secuencias de ácido nucleico puede determinarse mediante la comparación de la información de las secuencias utilizando el programa informático GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y ofrecido por el Grupo Informático de Genética de la Universidad de Wisconsin (UWGCG)... [Seguir leyendo]

1. Una célula de levadura que comprende un elemento sensor del estrés del retículo endoplasmático (RE) ligado operablemente a un elemento indicador y que comprende un gen exógeno que codifica una proteína que induce el estrés del RE, donde el elemento sensor del estrés del RE es una secuencia de ADN del elemento de respuesta a la proteína desplegada KAR2.

2. La célula tal como se reivindica en la reivindicación 1, donde el gen exógeno codifica un péptido A

j; el factor natriurético atrial, regulador transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) , receptor insulínico, Presenilina 1 (PS1) , transtiretina incluidos más de 45 mutantes, enteros o fragmentos, apolipoproteína AI, superóxido dismutasa 1 (SOD1) , receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) , gelsolina, tau incluido el tipo natural o el mutante, jgalactosidasa, j2-microglobulina, L2-microglobulina, cistatina c, lisozima, cadena a-A del fibrinógeno, apolipoproteína AI, apolipoproteína AII, FAH, huntingtina (Htt) , cadena ligera de la inmunoglobulina, insulina, calcitonina, a-sinucleína incluido el tipo natural o el mutante, parkina, proteína proteolipídica 1 (PLP1) , cadenas ligeras de Ig incluida la cadena entera o fragmentos, amiloide sérico A incluido el amiloide entero o un fragmento de 76 residuos, hemoglobina, receptor androgénico, ataxinas, proteína priónica (PrP) , proteína precursora del amiloide (APP) , amilina, PERK, WFS1 o alfa 1-antitripsina (AIAT) .

3. La célula de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde la secuencia de ADN del elemento de respuesta a la proteína desplegada KAR2 es la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO:1.

4. Un método para cribar un agente candidato por su habilidad para modular el estrés del RE que comprende los siguientes pasos:

a) poner en contacto una célula tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 con un agente candidato y

b) determinar el efecto del agente candidato en el nivel de expresión del elemento indicador.

5. Un método para producir una célula tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende la introducción de una secuencia nucleotídica que codifica un elemento sensor del estrés del RE, una secuencia nucleotídica que codifica un elemento indicador y una secuencia nucleotídica que codifica un gen exógeno en una célula.