Síntesis acelular de proteínas que contienen aminoácidos no naturales.

Un procedimiento para la síntesis de un polipéptido que contiene al menos un aminoácido no naturalen un sitio específico en una reacción acelular in vitro,

en que el procedimiento comprende: la síntesis delpolipéptido en una mezcla de reacción acelular de traducción in vitro que comprende un ARNt ortogonal que seaparea con un codón sin sentido, un extracto de células bacterianas derivado de una cepa bacteriana con ompTmutado, componentes de la maquinaria de síntesis de polipéptidos y/o ARNm; un molde para la transcripción delpolipéptido; monómeros para la síntesis del polipéptido; y cofactores, enzimas y otros reactivos necesarios para latraducción; en que la mezcla de reacción comprende una ARNt-sintetasa ortogonal sintetizada exógenamente queaminoacila el codón ortogonal con un aminoácido no natural; en que el polipéptido se sintetiza con al menos unaminoácido no natural en un sitio específico.

Síntesis acelular de proteínas que contienen aminoácidos no naturales.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La síntesis de proteínas es un proceso biológico fundamental que sirve de base al desarrollo de productos terapéuticos polipeptídicos, vacunas, procedimientos de diagnóstico y enzimas industriales. Con el advenimiento de la tecnología del ADN recombinante (ADNr) , se ha hecho posible el aprovechamiento de la maquinaria catalítica de la célula para producir una proteína deseada. Esto puede conseguirse dentro del entorno celular o in vitro, mediante extractos derivados de células.

La síntesis acelular de proteínas ofrece varias ventajas sobre los procedimientos de expresión de proteínas in vivo. Los sistemas acelulares pueden dirigir la mayor parte, si no todos, los recursos metabólicos de la 15 célula hacia la producción exclusiva de una proteína. Además, la falta de una pared celular in vitro es ventajosa porque permite el control del entorno de síntesis. Por ejemplo, es posible variar las concentraciones de ARNt para reflejar el uso de codones de los genes que se expresan. El potencial redox, el pH o la fuerza iónica pueden alterarse también con mayor flexibilidad que in vivo, porque no ha de tenerse en cuenta el crecimiento celular o la viabilidad. Además, puede llevarse a cabo fácilmente la recuperación directa de los productos proteínicos purificados y correctamente plegados.

La traducción in vitro también se reconoce por su capacidad para incorporar aminoácidos no naturales y marcados con isótopos, así como por su capacidad para producir proteínas que son inestables, insolubles o citotóxicas in vivo. Además, la síntesis acelular de proteínas puede desempeñar un papel en la revolución de las tecnologías de ingeniería de proteínas y análisis proteómico. El procedimiento acelular evita los laboriosos procedimientos requeridos para la clonación y la transformación celular para la expresión de nuevos productos génicos in vivo y está convirtiéndose en una tecnología de plataforma para este campo.

Bibliografía pertinente [0004] Patente de los EE. UU. n°7.045.337, concedida el 16 d e mayo de 2006.

Patente de los EE. UU. n°6.337.191 B1; Swartz y col., solicitud publicada de patente de los EE. UU. 20040209321; Swartz y col., solicitud publicada internacional WO 2004/016778; Swartz y col., solicitud publicada de 35 patente de los EE. UU. 2005-0054032-A1; Swartz y col., solicitud publicada de patente de los EE. UU. 20050054044-A1; Swartz y col., solicitud publicada internacional WO 2005/052117. Calhoun y Swartz (2005) Biotechnol. Bioeng. 90 (5) : 606-13; Jewett y Swartz (2004) Biotechnol. Bioeng. 86 (1) : 19-26; Jewett y col. (2002) Prokar y otic Systems for In Vitro Expression, en: Weiner M., Lu Q., editores, Gene cloning and expression technologies, Westborough, M. A., EE. UU., Eaton Publishing, págs. 391-411; Lin y col. (2005) Biotechnol. Bioeng. 89 (2) : 148-56;

Wang y col. (2001) Science 292 (5516) : 498-500; Wang y col. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (1) : 56-61; Chin y col. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124 (31) : 9026-7; Farrell y col. (2005) Nat. Methods 2 (5) : 377-84. Liu y col. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125 (7) : 1702-3.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan procedimientos para una síntesis acelular de proteínas de gran rendimiento con extractos de células bacterianas a partir de un molde polinucleotídico, en que la proteína sintetizada se modifica para comprender uno o más aminoácidos no naturales incorporados en sitios específicos. El extracto de células bacterianas se deriva de una cepa bacteriana en la que ompT está mutado. La proteína se sintetiza en una mezcla 50 de reacción acelular que comprende al menos un ARNt ortogonal aminoacilado con un aminoácido no natural, en que el ARNt ortogonal se aparea con un codón que normalmente no se asocia con ningún aminoácido, por ejemplo, un codón de parada; un codón de cuatro pb, etc. La mezcla de reacción comprende también una ARNt-sintetasa capaz de aminoacilar el ARNt ortogonal con un aminoácido no natural. Normalmente, la ARNt-sintetasa, que puede ser degradada por proteasas presentes en los extractos de células bacterianas, se sintetiza exógenamente y se 55 añade a la mezcla de reacción antes de la iniciación de la síntesis del polipéptido. El ARNt ortogonal puede sintetizarse en las células bacterianas de las que se obtiene el extracto celular, puede sintetizarse nuevamente durante la reacción de síntesis del polipéptido o puede añadirse exógenamente a la mezcla de reacción.

Los procedimientos de la invención proporcionan grandes rendimientos de proteína modificada activa.

Las proteínas producidas de esta manera, incluidas proteínas que contienen puentes disulfuro, proteínas secretadas, proteínas unidas a membranas, proteínas multiméricas, etc., son biológicamente activas. En algunas realizaciones, la síntesis se lleva a cabo como una reacción acoplada de transcripción y traducción.

En una realización, las condiciones de la reacción de síntesis proporcionan la activación in vitro de la fosforilación oxidativa. La activación de la fosforilación oxidativa puede ponerse de manifiesto por la sensibilidad de la síntesis a inhibidores de la cadena de transporte de electrones. Tales reacciones no contienen sustancialmente polietilenglicol.

El sistema de síntesis acelular de proteínas proporciona una plataforma flexible para la expresión de proteínas que contienen aminoácidos no naturales. En diversas realizaciones, el sistema se modifica para conseguir un resultado específico. El número y la naturaleza de los aminoácidos no naturales varía de acuerdo con la modificación deseada. Se usan diversas fuentes para el ARNt ortogonal y la ARNt-sintetasa, incluidas especies bacterianas, de arqueobacterias o de mamíferos.

A la mezcla de reacción se le añaden opcionalmente componentes que afectan la inserción de los aminoácidos no naturales y a la inserción o el plegamiento de las proteínas. Tales componentes incluyen concentraciones elevadas de factores de traducción para minimizar el efecto de los factores de liberación 1 y 2 y para optimizar aún más las concentraciones de los componentes ortogonales. También pueden añadirse chaperonas de proteínas (sistema Dsb de oxidorreductasas e isomerasas, GroES, GroEL, DNAJ, DNAK, Skp, etc.) de manera exógena a la mezcla de reacción o estas pueden expresarse en exceso en las células fuente usadas para preparar el extracto celular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Análisis mediante autorradiografía de la incorporación de o-metiltirosina (OMe-Tyr) en mGM-CSF mediante la estrategia I de incorporación de aminoácidos no naturales. Las cantidades de ARNt ortogonal (o-) purificado de Methanococcus jannaschii y de o-metiltirosina-sintetasa añadidas en las reacciones acelulares PANOx-SP se variaron. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de Bis-Tris NuPAGE al 10% y se compararon con el estándar de peso molecular Mark 12. La banda 1 consta de productos proteínicos diméricos, la banda 2 corresponde a productos proteínicos de longitud completa que incorporan o-metiltirosina y la banda 3 es un producto proteínico truncado (truncado en el resto 75) . El carril 2 muestra un estándar de mGM-CSF purificada con todos los aminoácidos naturales.

Figura 2. Rendimientos de la síntesis acelular de proteínas para la incorporación de o-metiltirosina en cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT) mediante distintas estrategias de desarrollo del procedimiento. Las concentraciones de CAT activa se determinaron por medio de un ensayo de actividad a base de colorimetría [26] y se confirmaron por recuento de centelleo después de la incorporación de L-[U-14C]-leucina. El análisis mediante autorradiografía se llevó a cabo con un gel de Bis-Tris NuPAGE al 10% en el tampón MES. Estos datos son la media de n = 6 experimentos.

Figura 3. Análisis mediante autorradiografía de CAT con p-azidofenilalanina (los resultados con ometiltirosina y p-acetilfenilalanina fueron similares) . Los autorradiogramas se revelaron a partir de geles de Bis-Tris NuPAGE al 10%, cuya electroforesis se llevó a cabo en el tampón MES. (A) Producción de proteína modificada 45 después de una reacción acelular de 5 h a 30°C tras la transcripción controlada del ARNt en el extracto celular (ejemplo derivado de la cepa celular KC6) y con la adición de cantidades crecientes de la sintetasa ortogonal. (B, C) Autorradiografía de la evolución temporal y rendimientos de CAT activa durante la síntesis acelular de proteínas en el sistema PANOx-SP-AAnn. Se usaron aproximadamente 167 µg/ml de p-azidofenilalanina-sintetasa ortogonal en la reacción... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la síntesis de un polipéptido que contiene al menos un aminoácido no natural en un sitio específico en una reacción acelular in vitro, en que el procedimiento comprende: la síntesis del 5 polipéptido en una mezcla de reacción acelular de traducción in vitro que comprende un ARNt ortogonal que se aparea con un codón sin sentido, un extracto de células bacterianas derivado de una cepa bacteriana con ompT mutado, componentes de la maquinaria de síntesis de polipéptidos y/o ARNm; un molde para la transcripción del polipéptido; monómeros para la síntesis del polipéptido; y cofactores, enzimas y otros reactivos necesarios para la traducción; en que la mezcla de reacción comprende una ARNt-sintetasa ortogonal sintetizada exógenamente que aminoacila el codón ortogonal con un aminoácido no natural; en que el polipéptido se sintetiza con al menos un aminoácido no natural en un sitio específico.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que la ARNt-sintetasa ortogonal sintetizada exógenamente se añade a la mezcla de reacción a una concentración de al menos 30 µg/ml. 15

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en que el ARNt ortogonal se sintetiza endógenamente por las bacterias que son la fuente del extracto de células bacterianas.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicha mezcla de reacción produce al

menos aproximadamente 50 µg/ml de proteína que contiene al menos un aminoácido no natural en un sitio específico.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en que al menos el 50% de dicha proteína que contiene al menos un aminoácido no natural en un sitio específico es biológicamente activa. 25

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en que dicha proteína que contiene al menos un aminoácido no natural en un sitio específico se sintetiza en una reacción acoplada de transcripción y traducción.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que el ARNt ortogonal se aparea con un codón 30 de parada.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que en la reacción acelular de traducción in vitro la fosforilación oxidativa está activada.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en que se añaden vesículas de membrana exógenas a dicha reacción acelular de traducción in vitro.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicha proteína que contiene al menos un aminoácido no natural en un sitio específico es una proteína unida a la membrana, una proteína secretada o una 40 proteína que comprende al menos un puente disulfuro.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que el polipéptido es una proteína de la cubierta de un virus, como una proteína de la cubierta de un bacteriófago, por ejemplo, del bacteriófago MS2.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en que el polipéptido es la proteína de la cubierta de un virus y en que se sintetizan dos o más especies de proteína de cubierta.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en que el aminoácido no natural proporciona un grupo reactante que no está normalmente presente en el aminoácido. 50

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en que el aminoácido no natural es una fenilalanina o una tirosina modificadas.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en que el aminoácido no natural está modificado en las

posiciones orto o para, como un aminoácido elegido entre p-acetilfenilalanina, p-etinilfenilalanina, ppropargiloxifenilalanina y p-azidofenilalanina.

16. Un kit para usar en cualquiera de los procedimientos de acuerdo con las reivindicaciones 1-16.