Salmonella entérica serotipo Paratyphi A atenuada y usos de la misma.

Cepa de Salmonella Paratyphi A atenuada, teniendo dicha cepa una mutación atenuante en los loci guaBAy una mutación atenuante en el gen clpX.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/042148.

Solicitante: UNIVERSITY OF MARYLAND, BALTIMORE.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 520 WEST LOMBARD STREET BALTIMORE MD 21201 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: LEVINE, MYRON, M., BARRY,EILEEN,M, VINDURAMPULLE,CHRISTOFER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/12 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Algas unicelulares; Sus medios de cultivo (como novedades vegetales A01H 13/00).
  • C12N15/74 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes procariotas distintos a E. coli, p. ej. Lactobacillus, Micromonospora.

PDF original: ES-2431327_T3.pdf

 

Salmonella entérica serotipo Paratyphi A atenuada y usos de la misma.

Fragmento de la descripción:

Salmonella enterica serotipo Paratyphi A atenuada y usos de la misma.

SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional US nº 60/731.349 presentada el 28 de octubre de 2005.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La fiebre entérica causada por miembros del género Salmonella, incluyendo las fiebres tifoidea y paratifoidea, sigue constituyendo una importante carga de morbilidad y mortalidad entre las poblaciones de los países en vías de desarrollo (Lancet 2005; 366: 749-762) y representa un riesgo notable para los viajeros (Lancet Infect Dis. 2005; 5 (10) : 623-628) . Las incidencias de fiebre entérica causada por Salmonella enteric serotipo Typhi y Paratyphi A (S. Typhi y S. Paratyphi A) están aumentando debido a la aparición y propagación de variantes resistentes a los antibióticos (Lancet Infect Dis. 2005 5 (10) : 623-8) . Aunque en general la enfermedad clínica causada por S. Paratyphi A es algo más leve que la debida a S. Typhi, la primera puede resultar en una fiebre entérica en su estado más avanzado con toda una serie de complicaciones y, si no se trata o se trata incorrectamente, puede tener como consecuencia la muerte. Existe la necesidad de disponer de vacunas que sean seguras y eficaces para combatir infecciones por Salmonella.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una cepa de S. Paratyphi A atenuada, donde dicha cepa A tiene una mutación atenuante en los loci guaBA y una mutación atenuante en el gen clpX. En realizaciones preferentes, la cepa S. Paratyphi A tiene una mutación atenuante en el gen guaB, el gen guaA y el gen clpP. En una realización especialmente preferente, la cepa de Salmonella Paratyphi A tiene una mutación atenuante en el gen guaB, el gen guaA y el gen clpX. En otra realización preferente, la cepa de Salmonella Paratyphi A tiene una mutación atenuante en el gen guaB, el gen guaA, el gen clpP y el gen clpX.

En una realización, la mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce el nivel de expresión de los loci o los genes o bloquea la expresión de los loci o los genes.

En otra realización, la mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce la actividad de un polipéptido codificado por los loci o los genes o inactiva un polipéptido codificado por los loci o los genes.

En una realización preferente, la cepa de Salmonella Paratyphi A es la cepa S. Paratyphi A 9150.

La presente invención incluye también cepas de S. Paratyphi A según la presente invención que comprenden además un sistema de expresión plasmídico estabilizado.

En una realización preferente, el sistema de expresión plasmídico estabilizado comprende un vector de expresión que tiene (a) un casete de origen de replicación de número de copias restringido, (b) como mínimo un casete de destrucción postsegregacional, (c) como mínimo un casete de partición y (d) un casete de expresión.

En realizaciones preferentes, el casete de origen de replicación de número de copias restringido comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un origen de replicación que limita el vector de expresión a un número medio de copias plasmídicas de aproximadamente 2 a 75 copias por célula, (ii) un primer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación y (iii) un segundo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación.

En las mismas realizaciones, el casete de destrucción postsegregacional comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo un locus de destrucción postsegregacional, (ii) un tercer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus de destrucción postsegregacional y (iii) un cuarto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus de destrucción postsegregacional.

En las mismas realizaciones, el casete de partición comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo una función de partición, (ii) un quinto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la función de partición y (iii) un sexto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la función de partición.

En las mismas realizaciones, el casete de expresión comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor, (ii) un séptimo sitio de corte de enzima de

restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor y (iii) un octavo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor.

En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia oriE1 de SEQ ID nº: 28, la secuencia ori101 de SEQ ID nº: 30 y la secuencia ori15A de SEQ ID nº: 29.

En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica el locus de destrucción postsegregacional es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado ssb, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado asd, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema proteico phd-doc y una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema antisentido hok-sok. Con especial preferencia, el locus de destrucción postsegregacional es una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado ssb seleccionada del grupo consistente en el locus ssb de Shigella flexneri, el locus ssb de Salmonella Typhi y el locus ssb de E. coli. Aun más preferentemente, el sistema letal equilibrado ssb es un locus ssb que comprende un promotor inducible de ssb, un promotor constitutivo de ssb y una región codificadora de ssb de la cepa de S. flexneri 2a CVD 1208s mostrada en la SEQ ID nº: 34.

En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica la función de partición es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en el locus parA de E. coli de SEQ ID nº: 31 y el locus pSC101 par de E. coli de en SEQ ID nº: 32.

En realizaciones preferentes, el promotor es un promotor inducible, en especial un promotor de ompC y con mayor preferencia el promotor de ompC mostrado en la SEQ ID nº: 33.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno homólogo. En otra realización, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno heterólogo.

En realizaciones preferentes, la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno heterólogo seleccionado del grupo consistente en un antígeno vírico, bacteriano, un antígeno de cáncer y un antígeno autoinmune.

La presente invención incluye también una formulación farmacéutica que comprende una o más de las cepas de Salmonella Paratyphi A atenuadas de la presente invención. Las formulaciones farmacéuticas son preferentemente formulaciones farmacéuticas orales.

La presente invención incluye además las formulaciones farmacéuticas de la presente invención para el uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una formulación farmacéutica de la presente invención a un sujeto. La respuesta inmunitaria es preferentemente una respuesta inmunitaria protectora.

La cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 102 cfu y aproximadamente 1010 cfu, con mayor preferencia entre aproximadamente 106 cfu y aproximadamente 109 cfu, de la cepa de S. Paratyphi A atenuada dentro de la formulación farmacéutica.

En una realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta a Salmonella Paratyphi A. En otra realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta al antígeno seleccionado. En otra realización más, la respuesta inmunitaria es una respuesta tanto a Salmonella Paratyphi A como al antígeno seleccionado.

Para mutar o delecionar diversos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Cepa de Salmonella Paratyphi A atenuada, teniendo dicha cepa una mutación atenuante en los loci guaBA y una mutación atenuante en el gen clpX.

2. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación atenuante en los loci guaBA es una mutación atenuante en el gen guaB o una mutación atenuante en el gen guaA o una mutación atenuante en ambos genes.

3. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque la mutación atenuante en los loci guaBA es una mutación atenuante en el gen guaB o una mutación atenuante en el gen guaA o una mutación atenuante en ambos genes y porque la cepa tiene una mutación atenuante adicional en el gen clpP.

4. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce el nivel de expresión de dichos loci o dichos genes o bloquea la expresión de dichos loci o dichos genes.

5. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mutación atenuante es una mutación atenuante que reduce la actividad de un polipéptido codificado por dichos loci o dichos genes o inactiva un polipéptido codificado por dichos loci o dichos genes.

6. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha cepa es la cepa S. Paratyphi A 9150.

7. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha cepa comprende además un sistema de expresión plasmídico estabilizado.

8. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 7, caracterizada porque dicho sistema de expresión plasmídico estabilizado comprende un vector de expresión que comprende:

(a) un casete de origen de replicación de número de copias restringido que incluye

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un origen de replicación que limita el vector de expresión a un número medio de copias plasmídicas de aproximadamente 2 a 75 copias por célula,

(ii) un primer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación y

(iii) un segundo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el origen de replicación;

(b) como mínimo un casete de destrucción postsegregacional que incluye

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo un locus de destrucción postsegregacional,

(ii) un tercer sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus o los loci de destrucción postsegregacional y

(iii) un cuarto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el locus o los loci de destrucción postsegregacional;

(c) como mínimo un casete de partición que comprende

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo una función de partición,

(ii) un quinto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la o las funciones de partición y

(iii) un sexto sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la o las funciones de partición; y

(d) un casete de expresión que comprende

(i) una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor,

(ii) un séptimo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor y

(iii) un octavo sitio de corte de enzima de restricción único situado en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado unido de manera operable a un promotor.

9. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica un origen de replicación es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en la secuencia oriE1 mostrada en SEQ ID nº: 28, la secuencia ori101 mostrada en SEQ ID nº: 30 y la secuencia ori15A mostrada en SEQ ID nº: 29.

10. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo un locus de destrucción postsegregacional es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado ssb, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema letal equilibrado asd, una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema proteico phd-doc y una secuencia de nucleótidos que codifica el sistema antisentido hok-sok.

11. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 10, caracterizada porque el sistema letal equilibrado ssb es un locus ssb seleccionado del grupo consistente en el locus ssb de Shigella flexneri, el locus ssb de Salmonella typhi y el locus ssb de E. coli.

12. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 10, caracterizada porque el sistema letal equilibrado ssb es un locus ssb que comprende un promotor inducible de ssb, un promotor constitutivo de ssb y una región codificadora de ssb de la cepa de S. flexneri 2a CVD 1208s mostrada en SEQ ID nº: 34.

13. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica como mínimo una función de partición es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo consistente en el locus parA de E. coli mostrado en SEQ ID nº: 31 y el locus pSC101 par de E. coli mostrado en SEQ ID nº: 32.

14. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque el promotor (d) (i) es un promotor inducible.

15. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 14, caracterizada porque el promotor (d) (i) es el promotor de ompC mostrado en SEQ ID nº: 33.

16. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado (d) (i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno homólogo.

17. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado (d) (i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno heterólogo.

18. Cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 8, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado (d) (i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno seleccionado del grupo consistente en un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno de cáncer y un antígeno autoinmune.

19. Formulación farmacéutica que comprende la cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Formulación farmacéutica que comprende la cepa de Salmonella Paratyphi A según la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Formulación farmacéutica según la reivindicación 19, caracterizada porque dicha formulación farmacéutica es una formulación farmacéutica oral.

22. Formulación farmacéutica según la reivindicación 20, caracterizada porque dicha formulación farmacéutica es una formulación farmacéutica oral.

23. Formulación farmacéutica según la reivindicación 19 para su uso en un método para inducir en un sujeto una respuesta inmunitaria a una cepa de Salmonella Paratyphi A atenuada.

24. Formulación farmacéutica según la reivindicación 20 para su uso en un método para inducir en un sujeto una respuesta inmunitaria a un antígeno seleccionado.

25. Formulación farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.

26. Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria protectora.

27. Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria al antígeno seleccionado.

28. Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria al antígeno seleccionado y una respuesta inmunitaria a la cepa de Salmonella Paratyphi A.

29. Formulación farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 102 cfu y aproximadamente 1010 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.

30. Formulación farmacéutica según la reivindicación 23, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 106 cfu y aproximadamente 109 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.

31. Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 102 cfu y aproximadamente 1010 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.

32. Formulación farmacéutica según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha cantidad inmunológicamente eficaz de la formulación farmacéutica contiene entre aproximadamente 106 cfu y aproximadamente 109 cfu de la cepa de S. Paratyphi A.

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

LD50 (log10 cfu por ratón)

Figura 7

LD50 (log10 cfu por ratón)

Figura 8

LD50 (log10 cfu por ratón)


 

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