Saccharomyces cerevisiae recombinante que expresa transportadores de glucosa quiméricos.

Levadura Saccharomyces cerevisiae modificada que produce niveles inferiores de etanol que levadura de tipo natural en condiciones aerobias y concentraciones de sacáridos de 5 mM o más y que presenta una tasa de crecimiento de al menos el 30% de la de la levadura de tipo natural,

conteniendo dicha levadura una secuencia de nucleótidos quimérica (un constructo quimérico) que se transforma de manera estable en el material genético de la levadura, en la que el constructo comprende una secuencia que tiene la forma

A-B

en la que A es una primera secuencia que comprende las bases de nucleótidos w a x;

B es una segunda secuencia que comprende las bases de nucleótidos (x+y) a z;

en la que

A es de una secuencia de nucleótidos que codifica para un transportador de sacáridos de baja afinidad HXT-1 o HXT-3 de la levadura Saccharomyces o una secuencia que se hibrida con la secuencia codificante en con- diciones de unión no rigurosas de 6 x SSC/formamida al 50% a temperatura ambiente y lavado en condicio- nes de alta rigurosidad o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia codificante o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente y

B es de una secuencia de nucleótidos que codifica para un transportador de sacáridos de alta afinidad HXT-2, 4, 6, 7 o GAL2P de la levadura Saccharomyces o una secuencia que se hibrida con la secuencia codificante en condiciones de unión no rigurosas de 6 x SSC/formamida al 50% a temperatura ambiente y lavado en condiciones de alta rigurosidad o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia codificante o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente y

los valores w y x son las posiciones de nucleótidos primera y segunda dentro de la secuencia de nucleótidos de dicho transportador de sacáridos de baja afinidad y (x+y) y z son las posiciones de nucleótidos primera y segunda dentro de la secuencia de nucleótidos de dicho transportador de sacáridos de alta afinidad, y;

w es de 1 a 50;

x es un número desde 400 hasta 900; y

es inferior a 3; y

z es de desde 1600 hasta 1713,

produciendo dicha levadura menos del 50% de etanol en comparación con la levadura de tipo natural.

Saccharomyces cerevisiae recombinante que expresa transportadores de glucosa quiméricos

La presente invención se refiere a una levadura que tiene propiedades de transporte de sacáridos, particularmente hexosa, modificadas y a su uso.

El fin de la invención es obtener una levadura que tiene propiedades de transporte de sacáridos, particularmente hexosa, modificadas mientras que simultáneamente se evita la producción de alcohol, en particular etanol en condiciones aerobias y altas concentraciones de sacáridos, particularmente hexosa.

La glucólisis de levaduras, la ruta que convierte azúcar en piruvato, tiene una capacidad masiva tal como se ha documentado por el hecho de que el 50-70% de la proteína celular de la levadura consiste en enzimas glucolíticas. De manera no sorprendente, esta ruta está controlada de un modo muy complejo y por diferentes mecanismos parcialmente redundantes (Fraenkel, 1982, Carbohydrate metabolism, págs. 1-37, en “The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae: Metabolism and gene expression” Cold Spring Harbor Laborator y , Cold Spring Harbor, N.Y.; Gancedo y Serrano, 1989, Energy-yielding metabolism, págs. 205-259, en “The Yeasts”, Rose y Harrison (Eds.) , segunda ed., vol. 3. Academic Press; Zimmermann y Entian, 1997, Yeast sugar metabolism, en “Biochemistr y , genetics, biotechnology and applications”, Technomic Publishing Co., Lancaster PA) . Algunos de estos parecen estar compartidos con rutas glucolíticas de otros organismos hasta seres humanos y plantas superiores, pero otros parecen ser únicos para levaduras.

La regulación de la glucólisis de levaduras se produce mediante control alostérico de enzimas clave en la ruta tales como fosfofructocinasa (PFK) y piruvato cinasa (Blazquez et al., 1993, FEBS Lett., 329, págs. 51-54; Boles et al., 1996, Mol. Microbiol., 20, págs. 65-76; Campbell-Burk y Shulman, 1987, Ann. Rev. Microbiol., 41, págs. 595-616; Davies y Brindle, 1992, Biochemistr y , 31, págs. 4729-4735; Gancedo y Serrano, 1989, citado anteriormente; Heinisch et al., 1996, J. Biol. Chem., 271, págs. 15928-15933) . Durante mucho tiempo, se consideró que la PFK era la (única) etapa limitante de la velocidad en la glucólisis. El desarrollo de la teoría de análisis del control metabólico ha mostrado que esto es una simplificación excesiva (Fell, 1997, en “Understanding the Control of Metabolism”, Portland Press, Londres y Miami) .

Un mecanismo de control que es probablemente específico para levaduras pero de importancia central funciona al nivel de la hexocinasa e implica metabolismo de trehalosa (Thevelein y Hohmann, 1995, Trends Biochem. Sci., 20, págs. 3-10) . La inactivación de trehalosa-6-fosfato sintasa provoca una ausencia de acumulación de trehalosa, pero también un defecto de crecimiento, específicamente cuando se hace crecer sobre glucosa (González et al., 1992, Yeast, 8, págs. 183-192; Van Aelst et al., 1993, Mol. Microbiol., 8, págs. 927-943) . La expresión de trehalosa-6-fosfato sintasa heteróloga en un mutante de S. cerevisiae que carece de la misma enzima restauró los niveles de trehalosa-6-fosfato así como el crecimiento sobre glucosa y el flujo de entrada de glucosa, al menos parcialmente (Bonini et al., 2000, Biochemical Journal, 15, págs. 261-268) .

También otros metabolitos y/o cometabolitos tales como ATP, ADP, NAD+ y Pi pueden estar implicados a diferentes niveles tales como el control alostérico y el denominado “control termodinámico” (alternativamente “concentración” o “control por metabolitos”) (Gancedo y Serrano, 1989, citado anteriormente) . Se ha encontrado una correlación “negativa” fuerte entre el contenido en ATP y el flujo glucolítico, que apunta a un control alostérico del flujo. En un estudio reciente se ha mostrado que la diana para la inhibición por ATP en células permeabilizadas estaba principalmente al nivel de fosfofructocinasa y piruvato cinasa (Larsson et al., 2000, Yeast, 16, págs. 797809) .

La alteración de la expresión de genes que codifican para enzimas glucolíticas y la proteolisis de enzimas glucolíticas son otros niveles de regulación y control, lo que está lejos de lo que se entiende cuando se considera el control glucolítico (Hohmann, 1997, págs. 187-211, en “Yeast sugar metabolism. Biochemistr y , genetics, biotechnology and applications”, Zimmermann y Entian (Eds.) , Technomic Publishing Co. Inc., Lancaster, PA; Larsson et al., 1997, J. Bacteriol., 179, págs. 7243-7250) .

La levadura S. cerevisiae tiene una flexibilidad metabólica notable y es una de las pocas levaduras que puede crecer de manera fermentativa en condiciones anaerobias estrictas (Visser et al., 1990, Appl. Environ. Microbiol., 56 (12) , págs. 3785-3792) . Durante condiciones aerobias y con simultáneamente concentraciones de glucosa externas relativamente altas, se ejerce el efecto de Crabtree, que da como resultado la producción de etanol también durante el crecimiento aerobio sobre azúcares fermentables (Fraenkel, 1982, citado anteriormente; Gancedo y Serrano, 1989, citado anteriormente) . Se han propuesto varias causas del efecto de Crabtree. En primer lugar, se ha sugerido que el aumento de los niveles extracelulares (o intracelulares) de glucosa provoca la represión de la actividad de elementos clave de la ruta respiratoria conduciendo en su lugar a procesamiento mediante la ruta de fermentación. Explicaciones alternativas sugieren que el efecto puede producirse simplemente a través de la sobrecarga de la ruta glucolítica conduciendo a una derivación de las fuentes de carbono a procesos fermentativos.

Tal como se mencionó anteriormente, la represión por glucosa (= represión por catabolitos (carbono) ) puede ser parte de la explicación de la producción aerobia de etanol durante el crecimiento sobre azúcares fermentables (Fraenkel, 1982, citado anteriormente; Gancedo y Serrano, 1989, citado anteriormente; Gancedo, 1992, Eur. J. Biochem., 206, págs. 297-313) . El efecto primario de la represión por glucosa es que la glucosa y fructosa son las fuentes de carbono preferidas si está disponible una mezcla de diferentes fuentes. Hay una serie completa de genes implicados en la represión por glucosa y el grado de represión se correlaciona con la capacidad de captación de glucosa. Esto sugiere que la tasa de utilización de glucosa determina la intensidad de la señal de glucosa relevante (Gancedo, 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, págs. 334-361) .

Sin embargo, se ha propuesto que la concentración de glucosa extracelular (o intracelular) , en vez del flujo de glucosa, desencadena la represión por glucosa (Meijer et al., 1998, J. Biol. Chem., 273, págs. 24102-24107) . Si se detecta la glucosa en el interior de la célula, entonces los transportadores pueden tener un papel indirecto no sólo en la generación de la señal inicial sino también en el mantenimiento de una señal de este tipo (Reifenberger et al., 1997, Eur. J. Biochem., 245, págs. 324-333; Walsh et al., 1994, J. Bacteriol., 176, págs. 953-958) .

Se ha mostrado recientemente que la concentración de glucosa intracelular es mucho más alta que la notificada anteriormente, es decir, de aproximadamente 1, 5 mM. Esta concentración es suficiente para reducir el flujo de entrada de glucosa en un 50% (Teusink et al., 1998, J. Bacteriol., 180, págs. 556-562) . Los autores de este estudio concluyeron que la glucosa intracelular es un fuerte candidato para la regulación de la importación de glucosa y por tanto de la glucólisis.

Durante concentraciones de azúcar externas diferentes, las células de levadura presentan sistemas de captación de azúcar de alta (Km de aproximadamente 1-3 mM) o baja (Km de aproximadamente 10-50 mM) afinidad (Bisson y Fraenkel, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, págs. 1730-1734; Walsh et al., 1994, citado anteriormente) . Las células que crecen en medios con baja concentración de glucosa presentan a menudo tanto un componente de alta afinidad como un componente de baja afinidad (Bisson y Fraenkel, 1983, citado anteriormente) . La glucosa se transporta al interior de la célula de levadura mediante difusión facilitada a través de diferentes proteínas portadoras específicas (Bisson et al., 1993, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28, págs. 259-308) .

Estudios genéticos han implicado a una familia génica, la familia HXT, que incluye 20 genes homólogos, en la codificación de transportadores de hexosa (Kruckeberg, 1996, Arch. Microbiol., 166, págs. 283-292; Diderich et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, págs. 15350-15359; Ozcan y Johnston, 1999, Microbiol. Mol. Biol., 63, págs. 554569) . La familia HXT pertenece a la superfamilia de facilitadores principal (Pao... [Seguir leyendo]

1. Levadura Saccharomyces cerevisiae modificada que produce niveles inferiores de etanol que levadura de tipo natural en condiciones aerobias y concentraciones de sacáridos de 5 mM o más y que presenta una tasa de crecimiento de al menos el 30% de la de la levadura de tipo natural, conteniendo dicha levadura una secuencia de nucleótidos quimérica (un constructo quimérico) que se transforma de manera estable en el material genético de la levadura, en la que el constructo comprende una secuencia que tiene la forma A-B

en la que A es una primera secuencia que comprende las bases de nucleótidos w a x;

B es una segunda secuencia que comprende las bases de nucleótidos (x+y) a z;

en la que A es de una secuencia de nucleótidos que codifica para un transportador de sacáridos de baja afinidad HXT-1

o HXT-3 de la levadura Saccharomyces o una secuencia que se hibrida con la secuencia codificante en condiciones de unión no rigurosas de 6 x SSC/formamida al 50% a temperatura ambiente y lavado en condiciones de alta rigurosidad o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia codificante o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente y

B es de una secuencia de nucleótidos que codifica para un transportador de sacáridos de alta afinidad HXT-2, 4, 6, 7 o GAL2P de la levadura Saccharomyces o una secuencia que se hibrida con la secuencia codificante en condiciones de unión no rigurosas de 6 x SSC/formamida al 50% a temperatura ambiente y lavado en condiciones de alta rigurosidad o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia codificante o una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente y

los valores w y x son las posiciones de nucleótidos primera y segunda dentro de la secuencia de nucleótidos de dicho transportador de sacáridos de baja afinidad y (x+y) y z son las posiciones de nucleótidos primera y segunda dentro de la secuencia de nucleótidos de dicho transportador de sacáridos de alta afinidad, y;

wes de 1 a 50;

x es un número desde 400 hasta 900;

y es inferior a 3; y

z es de desde 1600 hasta 1713,

produciendo dicha levadura menos del 50% de etanol en comparación con la levadura de tipo natural.

2. Levadura según la reivindicación 1, en la que dicho transportador de sacáridos es un transportador de glucosa.

3. Levadura según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha concentración de sacáridos es glucosa al 2%.

4. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, produciendo dicha levadura menos de 0, 6 g/l de etanol.

5. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, produciendo dicha levadura menos de 0, 25 g/l de etanol.

6. Levadura según la reivindicación 5, produciendo dicha levadura menos de 0, 12 g/l de etanol.

7. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, presentando dicha levadura una tasa de crecimiento de al menos el 50% de la de la levadura de tipo natural.

8. Levadura según la reivindicación 7, presentando dicha levadura una tasa de crecimiento de al menos el 70% de la de la levadura de tipo natural.

9. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho constructo comprende secuencias de HXT-1 y HXT 7 o una secuencia que se hibrida con la secuencia codificante en las condiciones definidas en la reivindicación 1 o tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la misma o una secuencia complementaria de la misma.

10. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que x es una posición en la secuencia de nucleótidos abarcada por los tramos transmembrana tercero a noveno de HXT1 o HXT7 o una secuencia que se hibrida con la secuencia codificante en las condiciones definidas en la reivindicación 1 o tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la misma o una secuencia complementaria de la misma.

11. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que x .

52. 575 y/.

72. 770.

12. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que x = 551 ó 741, w e y = 1 y z = 1713.

13. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho constructo quimérico codifica para un polipéptido quimérico con un total de 10 a 14 dominios transmembrana.

14. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho constructo comprende:

los nucleótidos 1-449 de HXT-1 y los nucleótido.

45. 1713 de HXT-7;

los nucleótidos 1-551 de HXT-1 y los nucleótido.

55. 1713 de HXT-7;

los nucleótidos 1-627 de HXT-1 y los nucleótido.

62. 1713 de HXT-7;

o una molécula de ácido nucleico que se hibrida con dicho constructo en las condiciones según la reivindicación 1 o tiene una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de dicho constructo.

15. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, siendo la célula de levadura en la que se introduce dicho constructo quimérico una cepa nula sin propiedades de transporte de sacáridos.

16. Levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho constructo quimérico comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias n.os 1 ó 2 o comprende la secuencia de nucleótidos de las secuencias n.os 3 ó 4 o una molécula que se hibrida con dicho constructo o con las secuencias n.os 3 ó 4 en las condiciones definidas en la reivindicación 1, o tiene una identidad de al menos el 95% con la secuencia de dicho constructo o con las secuencias n.os 3 ó 4.

17. Levadura según la reivindicación 15 ó 16 denominada Saccharomyces cerevisiae KOY.TM4P o KOY.TM6P que tiene el número de depósito DSM (Deutsche Sammlung Mikroorganismen) 13832 o DSM 13555, respectivamente.

18. Molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 o una secuencia complementaria a la misma.

19. Vector o célula huésped que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18.

20. Polipéptido que comprende una secuencia codificada por la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18, comprendiendo dicho polipéptido un transportador de sacáridos quimérico funcional.

21. Método de inserción de material genético exógeno en una célula de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para proporcionar una célula de levadura que produce un producto, comprendiendo dicho método al menos las etapas de introducir dicho material en dicha célula, en el que dicho material exógeno codifica para dicho producto o parte del mismo o codifica para un polipéptido o parte del mismo que facilita la producción directa o indirecta de dicho producto o parte del mismo, o que afecta a la expresión de dicho polipéptido o producto.

22. Método según la reivindicación 21, en el que dicho material genético exógeno que va a introducirse en dicha célula está contenido dentro de un vector.

23. Método según la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho producto es un metabolito de peso molecular alto o bajo, un producto químico fino o a granel, un producto alimenticio, un alimento funcional o un agente terapéutico.

24. Método según la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho producto es un aminoácido, un péptido, un polipéptido, un azúcar, un poliol pequeño o CO2.

25. Célula de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que se ha insertado material genético exógeno según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24 para proporcionar una célula de levadura que produce un producto.

26. Método de preparación de un producto, que comprende hacer crecer células de levadura según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 ó 25 en condiciones aerobias en presencia de altas concentraciones de sacáridos.

27. Método según la reivindicación 26, que comprende adicionalmente la etapa de aislar el producto así 5 formado.

28. Método según la reivindicación 26 ó 27, en el que dicho producto es una bebida baja en alcohol o no alcohólica.

29. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que dichas células se hacen crecer en presencia de glucosa.