Métodos para pretratar material celulósico con polipéptido GH61.

Método de degradación de un material celulósico, que comprende:

(a) pretratamiento del material celulósico con una composición que comprende uno o más polipéptidos GH61; y

(b) sacarificación del material celulósico pretratado con polipéptido GH61 con una composición enzimática.

Métodos para pretratar material celulósico con polipéptido GH61 Investigación y desarrollo patrocinados con fondos federales

[1] Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno bajo el Acuerdo Cooperativo DE-FC36-8G188 otorgado por el Departamento de Energía. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Referencia a un listado de secuencias

[2] Este documento contiene un listado de secuencias.

Antecedentes de la Invención

Campo de la Invención

[3] La presente Invención se refiere a métodos para degradar o convertir un material celulósico por pretratamiento con un polipéptido GH61.

Descripción de las técnicas relacionadas

[4] La celulosa es un polímero de glucosa de azúcar simple enlazado de manera covalente por beta-1,4-enlaces. Muchos microorganismos producen enzimas que hidrolizan glucanos beta-enlazados. Estas enzimas incluyen endoglucanasas, celoblohldrolasas y beta-glucosidasas. Las endoglucanasas asimilan el polímero de celulosa en ubicaciones al azar, abriendo éstas para el ataque por celobiohidrolasas. Las celobiohidrolasas liberan secuencialmente moléculas de celoblosa a partir de los extremos del polímero de celulosa. La celobiosa es un dímero de glucosa beta- 1,4-enlazado hidrosoluble. Las beta-glucosidasas hidrolizan celobiosa en glucosa.

[5] La conversión de materias primas lignocelulósicas en etanol tiene las ventajas de la disponibilidad inmediata de grandes cantidades de materia prima, la conveniencia de evitar el quemado o enterrado de los materiales y la limpieza del combustible de etanol. Madera, residuos agrícolas, plantas de cultivo herbáceas y desperdicios sólidos municipales se han considerado materias primas para la producción de etanol. Estos materiales principalmente consisten en celulosa, hemlcelulosa y lignina. Una vez que la llgnocelulosa se convierte en azúcares fermentables, por ejemplo, glucosa, los azúcares fermentables son fácilmente fermentados por levadura en los productos de fermentación, por ejemplo, etanol.

[6] La WO 25/74647, WO 28/148131 y WO 211/3527 divulgan pollpéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítlco y sus pollnucleótidos de Thielavia terrestris. La WO 25/74656 y la WO 21/6583 divulgan pollpéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítico y sus polinucleótidos de Thermoascus aurantiacus. La WO 27/8929 divulga un polipéptido GH61 aislado que tiene actividad de aumento celulolítico y su polinucleótido de Trichoderma reesei. La WO 29/85935, WO 29/85859, WO 29/85864 y WO 29/85868 divulgan pollpéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítico y sus polinucleótidos de Myceliophthora thermophila. La WO 21/138754 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítico y sus polinucleótidos de Aspergillus fumigatus. La WO 211/5867 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítico y sus polinucleótidos de Penicillium pinophilum. La WO 211/39319 divulga pollpéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítico y sus polinucleótidos de Thermoascus sp. La WO 211/41397 divulga pollpéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítico y sus polinucleótidos de Penicillium sp. La WO 211/4154 divulga polipéptidos GH61 aislados que tienen actividad de aumento celulolítico y sus polinucleótidos de Thermoascus crustaceous. La WO 28/15143 divulga métodos para aumentar la actividad de un polipéptido GH61 que tienen actividad potenciadora celulolítica añadiendo un catión metálico bivalente de activación soluble a una composición que comprende el polipéptido.

[7] Harris ef al. Blochemlstry, 21, vol. 49, pp. 335-3316, se refiere a la estimulación de la hidrólisis de biomasa llgnocelulósica por proteínas de la familia 61 de glicósido hidrolasa.

[8] Quinlan et al., PNAS, September 211, vol. 18, no. 37, pp. 1579-1584 se refiere a la degradación oxidativa de celulosa por una metaloenzlma de cobre.

[9] Sería una ventaja en la técnica poder mejorar el pretratamiento de un material celulósico para la producción de etanol.

Resumen de la invención

[1] La presente invención se refiere a métodos para la degradación de un material celulósico, que comprenden:

(a) pretratamiento del material celulósico con una composición que comprende uno o más (por ejemplo, varios) polipéptidos GH61; y

(b) sacarificación del material celulósico pretratado con polipéptido GH61 con una composición enzimátlca.

[11] La presente Invención también se refiere a métodos de producción de un producto de fermentación, que comprenden:

(a) pretratamlento de un material celulósico con una composición que comprende uno o más (por ejemplo, varios) polipéptidos GH61;

(b) sacarificación del material celulósico pretratado con polipéptido GH61 con una composición enzimática;

(c) fermentación del material celulósico sacarificado con uno o más (por ejemplo, varios) microorganismos fermentativos para producir el producto de fermentación; y

(d) recuperación del producto de fermentación a partir de la fermentación.

Breve descripción de las figuras

[12]

La figura 1 muestra la hidrólisis fraccional de (A) PCS (rastrojos de maíz pretratados) molidos pretratados con enzima, lavados con agua callente por una composición de celulosa de T. reesei en presencia de la Indicada concentración de polipéptido GH61E de T. terrestrís; los PCS lavados con agua caliente fueron pretratados por las enzimas indicadas durante 1 día; y (B) PCS molidos pretratados con enzima, lavados con agua caliente por una composición de celulasa de T. reesei en presencia de la Indicada concentración de polipéptido GH61 de T. terrestrís', los PCS lavados con agua callente fueron pretratados por las enzimas indicadas durante 3 días.

La figura 2 muestra una comparación de la hidrólisis fracclonal de 1 y 3 días de PCS molido pretratado con polipéptido GH61E de T. terrestrís, lavado con agua caliente por una composición de celulasa de T. reesei en presencia de la indicada concentración de polipéptido GH61 de T. terrestrís.

Definiciones

[13] Acetilxilano esterasa: el término "acetilxilano esterasa" se refiere a una carboxilesterasa (EC 3.1.1.72) que cataliza la hidrólisis de grupos de acetllo a partir de xilano pollmérlco, xllosa acetllada, glucosa acetilada, alfa-naptil acetato y p-nitrofenil acetato. La actividad de la acetilxilano esterasa se determina usando ,5 mM de p-nitrofenilacetato como sustrato en 5 mM de acetato sódico pH 5, que contiene ,1% de TWEEN 2 (monolaurato de polioxietileno sorbitán). Una unidad de acetilxilano esterasa se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 de anión de p-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.

[14] Variante alélica: el término "variante alélica" se refiere a cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutación, y puede resultar en polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones de gen pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o puede codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[15] Alfa-L-arablnofuranosidasa: el término "alfa-L-arablnofuranosidasa" se refiere a una arablnofuranohldrolasa de alfa-L-arablnofuranósida (EC 3.2.1.55) que cataliza la hidrólisis de residuos de alfa-L-arablnofuranosida terminales no reductores en alfa-L-arabinósidos. La enzima actúa en alfa-L-arablnofuranósidos, alfa-L-arablnanos que contiene (1,3)- y/o (1,5)-enlaces, arabinoxilanas y arablnogalactanos. Alfa-L-arablnofuranosidasa es también conocida como arablnosldasa, alfa-arabinosidasa, alfa-L-arablnosidasa, alfa-arablnofuranosldasa, pollsacárldo alfa-L- arablnofuranosidasa, alfa-L-arabinofuranosida hldrolasa, L-arablnosidasa o alfa-L-arablnanasa. La actividad de alfa-L- arablnofuranosidasa se determina usando 5 mg de arablnoxllano de trigo de viscosidad media (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mi de 1 mM de acetato sódico pH 5 en un volumen total de 2 pl durante 3 minutos a 4°C seguido de análisis de arablnosa por cromatografía en columna AMINEX® HPX-87H (Blo- Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE.UU.).

[16] Alfa-glucuronldasa: el término "alfa-glucuronldasa" se refiere a una alfa-D-glucosIduronato glucuronohldrolasa (EC 3.2.1.139) que cataliza la hidrólisis de un alfa-D-glucuronosIda en D-glucuronato y un alcohol. La actividad de alfa- glucuronldasa se determina según de Vries, 1998, J. Bacterlol. 18: 243-249.... [Seguir leyendo]

1. Método de degradación de un material celulósico, que comprende:

(a) pretratamlento del material celulósico con una composición que comprende uno o más pollpéptidos GH61; y

(b) sacarificación del material celulósico pretratado con polipéptido GH61 con una composición enzimática.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende además el tratamiento del material celulósico con un pretratamiento químico, un pretratamiento físico o un pretratamiento químico y un pretratamiento físico.

3. Método según la reivindicación 2, donde el pretratamiento con uno o más polipéptidos GH61 se realiza antes, durante o después del pretratamiento químico, el pretratamiento físico o el pretratamiento químico y el pretratamiento físico.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el o los polipéptidos GH61 se inactivan tras el pretratamiento del material celulósico.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la composición enzimática comprende una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en una celulasa, un polipéptido GH61 que tiene actividad de aumento celulolítico, una hemicelulasa, una esterasa, una expansina, una lacasa, una enzima ligninolítica, una pectinasa, una peroxidasa, una proteasa y una swollenina.

6. Método para producir un producto de fermentación, que comprende:

(a) pretratamiento de un material celulósico con una composición que comprende uno o más polipéptidos GH61;

(b) sacarificación del material celulósico pretratado con GH61 con una composición enzimática;

(c) fermentación del material celulósico sacarificado con uno o más microorganismos de fermentación para producir el producto de fermentación; y

(d) recuperación del producto de fermentación a partir de la fermentación.

7. Método según la reivindicación 6, que comprende además el tratamiento del material celulósico con un pretratamiento químico, un pretratamiento físico o un pretratamiento químico y un pretratamiento físico.