Procedimiento de producción de vitaminas.

Procedimiento de fermentación para producir farnesol o geranilgeraniol,

o las formas fosfato de los mismos, es decir pirofosfato de farnesilo (FPP) o pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP), que comprende:

a) proporcionar un microorganismo que ha sido modificado genéticamente para incrementar el número de copias de genes de HMG-CoA reductasa, cuyo microorganismo es capaz de producir farnesol, geranilgeraniol, FPP o GGPP en un medio de fermentación en el que el medio de fermentación comprende una fuente de carbono en una cantidad inicial entre 1 gramo por litro y 100 gramos por litro de medio de fermentación;

b) cultivar el microorganismo recombinante en condiciones en las que la fuente de carbono en el medio de fermentación se agota y se reconstituye durante la fermentación; y

c) recuperar dicho producto,

en el que se reduce la actividad de escualeno sintasa de dicho microorganismo, y en el que si el microorganismo es capaz de producir geranilgeraniol o GGPP, el microorganismo comprende además un gen que codifica GGPP sintasa.

Procedimiento de producción de vitaminas 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a procedimientos de producción de vitaminas, particularmente de vitaminas Ay E y compuestos relacionados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La vitamina E (d-alfa-tocoferol, 1) es un complemento nutricional importante en seres humanos y animales. El compuesto 1 se obtiene comercialmente mediante aislamiento de una variedad de aceites vegetales, o semisintéticamente mediante metilación de anillo del d-gamma-tocoferol 2 de origen natural relacionado. Es una

fuente más importante de vitamina E la síntesis total, que proporciona d,l-alfa-tocoferol 3. Aunque es una mezcla de isómeros, 3 proporciona mucha de la actividad biológica de 1 y se usa ampliamente debido a su menor coste y mayor disponibilidad. Para una discusión general de la vitamina E, véase L. Machlin, ed., "Vitamin E: A Comprehensive Treatise", Marcel Dekker, NY, 1980.

OH

El d,l-alfa-tocoferol 3 se obtiene haciendo reaccionar trimetilhidroquinona 4 con fitol 5 o isofitol 6 en presencia de un catalizador ácido, a menudo un ácido de Lewis tal como cloruro de cinc. Esta tecnología se ha revisado por S. Kasparek en L. Machlin, ed., "Vitamin E: A Comprehensive Treatise", capítulo 2, pág. 8-65, Marcel Dekker, NY, 1965. Las referencias 140-166 de este capítulo proporcionan las referencias primarias de procedimientos detallados de preparación del compuesto 3.

El isofitol 6 o fitol 5 necesarios para la preparación de 3 se obtienen mediante una síntesis multietapa. Los materiales de partida Incluyen típicamente acetona (véase Kasparek en Machlin, "Vitamin E: A Comprehensive Treatlse", pág. 44-45, Dekker, NY 1980, y referencias citadas en la misma) y trímero cíclico de isopreno (Pond y col., US 3.917.710 y 3.862.988 (1975)).

[0003] Además, se preparó en primer lugar gamma-tocoferol mediante síntesis total por Jacob, Steiger, Todd y Wilcox ÍJ. Chem. Soc. 1939, 542). Estos investigadores produjeron la vitamina haciendo reaccionar el áster de monobenzoato de 2,3-dlmetilhidroquinona con bromuro de titilo en presencia de cloruro de cinc, seguido de la retirada del benzoato, dando un bajo rendimiento (22%) de gamma-tocoferol. Las síntesis publicadas de tocoferoles y tocotrienoles se han revisado por S. Kasparek en L. Machlin, "Vitamin E - A Comprehensive Treatise", Dekker, NY, 1980; sin embargo, no se han registrado procedimientos adicionales de preparación de gamma-tocoferol.

[0004] A pesar de los diversos procedimientos conocidos para preparar o aislar miembros de la familia de la vitamina E de compuestos, continúa habiendo la necesidad de procedimientos de producción mejorados y más eficaces.

[0005] Se usan vitamina A (retinol) y la provitamina A p-caroteno en productos farmacéuticos, enriquecimiento alimenticio y complementos dietéticos. El acetato (acetato de retinilo), propionato (propionato de retlnllo) y palmltato (palmltato de retinilo) de la vitamina A son los derivados de vitamina A más generalmente usados. Todos de vitamina A, ásteres de vitamina A y p-caroteno actualmente producidos comercialmente se producen mediante síntesis química total, excepto algo de vitamina A que se aísla a partir de fuentes alimenticias. Véase en general "Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology", volumen 24, páginas 140-158 (3a ed. 1984).

[0006] Misawa y Shimada, J Biotechnol. 3 enero 1997; 59(3): 169-8 describen la ruta metabólica para la producción de carotenoides en bacterias y levaduras no carotenogénicas.

[0007] Simada et al., Appl Environ Microbiol. Julio 1998; 64(7): 2676-80, describen una mayor producción de carotenoides por la levadura de la comida Candida utilis a través de la ruta metabólica del mecanismo de los isoprenoides.

[0008] El documento EP-A-0486290 describe un procedimiento y composición para incrementar la acumulación de escualeno y esteróles específicos en levadura.

[0009] Continúa habiendo la necesidad de procedimientos mejorados y económicos de producción de vitamina Ay ásteres de vitamina A.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[00010]

La Figura 1A ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides dependiente de mevalonato.

La Figura 1B ilustra una representación esquemática de la ruta biosintética de isoprenoides independiente de mevalonato.

La Figura 2 ilustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de geranilgeraniol.

La Figura 3 ¡lustra una realización de una vía para la síntesis química de vitamina E a partir de farnesol.

La Figura 4 ilustra el crecimiento y la producción de farnesol de cepas derivadas de la cepa MBNA1-13.

La Figura 5 ¡lustra el crecimiento de cepas naturales, erg9 y con ERG9 reparado.

La Figura 6 ¡lustra la producción de farnesol en microorganismos con producción amplificada de FIMG-CoA reductasa.

La Figura 7 ¡lustra la producción de farnesol y GG en cepas que sobreexpresan GGPP sintasas.

La Figura 8 ¡lustra el efecto de la producción amplificada de FPP sintasa sobre la producción de farnesol y GG.

La Figura 9 ¡lustra la ruta de conversión metabólica de isoprenol y prenol en farnesol.

La Figura 10 ¡lustra una vía de síntesis química para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol.

La Figura 11 ¡lustra una vía de síntesis química alternativa para la producción de acetato de vitamina A a partir de farnesol.

La Figura 12 ¡lustra un procedimiento para preparar (3-caroteno a partir de retinal usando una reacción de acoplamiento de carbonilo.

La Figura 13 ¡lustra un procedimiento para preparar (3-caroteno usando una reacción de alquilación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1.0 Introducción

[00011] La presente invención proporciona un procedimiento de fermentación para la producción de farnesol o geranilgeraniol, o las formas fosfato de los mismos, es decir, farnesilpirofosfato (FPP) o geranilgeranilpirofosfato (GGPP), que comprende: a) proporcionar un microorganismo que se ha modificado genéticamente para incrementar el número de copias del gen de FIMG-CoA reductasa, cuyo microorganismo es capaz de producir farnesol, geranilgeraniol, FPP o GGPP en un medio de fermentación, en el que el medio de fermentación comprende una fuente de carbono en una cantidad inicial entre aproximadamente 1 gramo por litro y aproximadamente 100 gramos por litro de medio de fermentación; b) cultivar el microorganismo recombinante en condiciones en las que la fuente de carbono en el medio de fermentación se agota y se reconstituye durante la fermentación; y c) recuperar dicho producto, en el que se reduce la actividad de escualeno sintasa de dicho microorganismo, y en el que si el microorganismo es capaz de producir geranilgeraniol o GGPP, el microorganismo comprende además un gen que codifica GGPP sintasa.

[00012] Las realizaciones adicionales de la Invención se establecen en las reivindicaciones que se acompañan.

[00013] También se describe en el presente documento un procedimiento para producir a-tocoferol y ásteres de a-tocoferilo en el que se utiliza un sistema biológico para producir farnesol o geranilgeraniol (GG). El farnesol se puede utilizar como material de partida para sintetizar químicamente el producto final, ásteres de a-tocoferilo. Alternativamente, el farnesol se puede convertir químicamente en GG. El GG, producido biológicamente o mediante síntesis a partir del farnesol, se puede utilizar a continuación como material de partida para producir a-tocoferilo y ésteres de a-tocoferilo. La presente descripción también incluye varios aspectos de materiales biológicos e Intermedios útiles en la producción de farnesol o GG mediante producción biológica. La presente descripción también incluye procedimientos de producción de a-tocoferol y ésteres de a-tocoferilo utilizando farnesol y/o GG producidos mediante cualquier medio como material de partida.

[00014] La presente descripción también se refiere a un procedimiento para producir vitamina A a partir de farnesol. En una realización preferida, el farnesol se produce biológicamente.

2.0 Producción biológica de farnesol v GG

[00015] Los isoprenoides son la mayor familia de productos naturales, con aproximadamente 22.000 estructuras diferentes conocidas. Todos los isoprenoides derivan del compuesto Cs plrofosfato de isopentilo (IPP). Por tanto, las cadenas principales carbonadas de todos los compuestos Isoprenoides se crean mediante adiciones secuenciales de las unidades Cs a la cadena poliprenoide en crecimiento.

[00016] Aunque las etapas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de fermentación para producir farnesol o geranilgeraniol, o las formas fosfato de los mismos, es decir pirofosfato de farnesilo (FPP) o pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP), que comprende:

a) proporcionar un microorganismo que ha sido modificado genéticamente para incrementar el número de copias de genes de HMG-CoA reductasa, cuyo microorganismo es capaz de producir farnesol, geranilgeraniol, FPP o GGPP en un medio de fermentación en el que el medio de fermentación comprende una fuente de carbono en una cantidad inicial entre 1 gramo por litro y 100 gramos por litro de medio de fermentación;

b) cultivar el microorganismo recombinante en condiciones en las que la fuente de carbono en el medio de fermentación se agota y se reconstituye durante la fermentación; y

c) recuperar dicho producto,

en el que se reduce la actividad de escualeno sintasa de dicho microorganismo, y en el que si el microorganismo es capaz de producir geranilgeraniol o GGPP, el microorganismo comprende además un gen que codifica GGPP sintasa.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la cantidad inicial de la fuente de carbono es entre 2 gramos por litro y 50 gramos por litro de medio de fermentación.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la fermentación se lleva a cabo en modo de alimentación por lotes, de manera que la fuente de carbono se mantiene en un nivel deseado antes del agotamiento.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el microorganismo alcanza una densidad celular de 10 g/l a 100 g/l.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos y trisacáridos.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, en el que la fuente de carbono es glucosa.

7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la concentración de nitrógeno asimilable en la etapa de cultivo se mantiene en menos de 20 g/l en el medio de fermentación.

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que la concentración de nitrógeno asimilable se mantiene en menos de 5 g/l en el medio de fermentación.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que la concentración de nitrógeno asimilable se deja que se agote de las fuentes de nitrógeno durante la fermentación.

10. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que la fuente de nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en amoniaco anhidro y sales de amonio.

11. Procedimiento, según la reivindicación 7, en el que la fuente de nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en hidrolizados de proteína, hidrolizados de biomasa microbiana, peptona, extracto de levadura, sulfato de amonio, urea y aminoácidos.

12. Procedimiento, según la reivindicación 9, en el que las condiciones de cultivo se mantienen entre 20°C y 45°C.

13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho microorganismo es una levadura.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha HMG-CoA reductasa (HMGR) es una HMGR truncada en la que se ha extraído el dominio regulador.

16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la HMGR está integrada en el genoma del microorganismo.

17. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho microorganismo es un mutante erg9.

18. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo comprende niveles elevados de HMG CoA reductasa, junto con niveles elevados de mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa, difosfomevalonato descarboxilasa e IPP isomerasa.