Receptores mutantes por sustitución novedosos y su uso en un sistema de expresión génica inducible basado en receptores nucleares.

Sistema de modulación de la expresión génica que comprende un casete de expresión génica que puedeexpresarse en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido quecomprende:

i) un dominio de transactivación,

ii) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión ha demodularse, y

iii) un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución;en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H procede de un receptor nuclear de grupo Hseleccionado del grupo que consiste en un receptor de ecdisona, un receptor ubicuo, un receptor huérfano 1, unNER-1, un receptor nuclear de hormonas esteroideas 1, una proteína 15 de interacción de receptor retinoide X,receptores hepáticos X β, una proteína similar al receptor de hormonas esteroideas, un receptor hepático X, unreceptor hepático X α, un receptor farnesoide X, una proteína 14 de interacción de receptor, y un receptor defarnesol, en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H se codifica por un polinucleótidoque comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido,estando el residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a:

a) residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1,

b) residuos de aminoácido 107 y 175 de SEQ ID NO: 1,

c) residuos de aminoácido 107 y 127 de SEQ ID NO: 1,

d) residuos de aminoácido 107, 127 y 175 de SEQ ID NO: 1, o

e) residuos de aminoácido 52, 107 y 175 de SEQ ID NO: 1; y

en el que la(s) mutación/mutaciones por sustitución da(n) como resultado un aumento en la actividad de receptornuclear de grupo H en respuesta a ligandos esteroideos y no esteroideos, con respecto a la actividad de un receptornuclear de grupo H en el que el residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido 107 en SEQ ID NO: 1 es valina.

Receptores mutantes por sustitución novedosos y su uso en un sistema de expresión génica inducible basado en receptores nucleares

Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de biotecnología o ingeniería genética. Específicamente, esta invención se refiere al campo de la expresión génica. Más específicamente, esta invención se refiere a receptores nucleares novedosos que comprenden una mutación por sustitución y a su uso en un sistema de expresión génica inducible basado en receptores nucleares y a métodos de modulación de la expresión de un gen dentro de una célula huésped usando este sistema de expresión génica inducible.

Antecedentes de la invención La mención de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que tal referencia está disponible como “técnica anterior” para la presente solicitud.

En el campo de ingeniería genética, el control preciso de la expresión génica es una herramienta valiosa para estudiar, manipular y controlar el desarrollo y otros procesos fisiológicos. La expresión génica es un proceso biológico complejo que implica varias interacciones proteína-proteína específicas. Con el fin de desencadenar la expresión génica, de modo que se produzca el ARN necesario como primera etapa en la síntesis de proteínas, debe colocarse un activador de la transcripción en proximidad de un promotor que controla la transcripción génica. Normalmente, el propio activador de la transcripción está asociado con una proteína que tiene al menos un dominio de unión a ADN que se une a sitios de unión a ADN presentes en las regiones promotoras de genes. Por tanto, para que se produzca la expresión génica, una proteína que comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de transactivación ubicados a una distancia apropiada del dominio de unión a ADN deben colocarse en la posición correcta en la región promotora del gen.

El enfoque transgénico tradicional utiliza un promotor específico de tipo celular para dirigir la expresión de un transgén diseñado. En primer lugar se incorpora un constructo de ADN que contiene el transgén en un genoma huésped. Cuando se desencadena por un activador de la transcripción, se produce la expresión del transgén en un tipo celular dado.

Otros medios para regular la expresión de genes foráneos en células es a través de promotores inducibles. Los ejemplos del uso de tales promotores inducibles incluyen el promotor PR1-a, sistemas de represor-operador procariotas, sistemas de inmunosupresor-inmunofilina y sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas y se describen a continuación.

El promotor PR1-a del tabaco se induce durante la respuesta de resistencia adquirida sistémica tras un ataque de de patógenos. El uso de PR1-a puede limitarse debido a que a menudo responde a materiales endógenos y factores externos tales como patógenos, radiación UV-B y contaminantes. Se han descrito sistemas de regulación génica basados en promotores inducidos por choque térmico, interferón y metales pesados (Wum et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5414-5418; Amheiter et al., 1990, Cell 62:51-61; Filmus et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 27550-27560) . Sin embargo, estos sistemas tienen limitaciones debido a su efecto sobre la expresión de genes no diana. Estos sistemas también tienen brechas.

Los sistemas de represor-operador procariotas utilizan proteínas represoras bacterianas y las secuencias de ADN de operador únicas a las que están unidas. Se han usado tanto los sistemas de represor-operador de tetraciclina (“Tet”) como de lactosa (“Lac”) de la bacteria Escherichia coli en plantas y animales para controlar la expresión génica. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteína represora TetR, dando como resultado un cambio conformacional que libera la proteína represora del operador que como resultado permite que se produzca la transcripción. En el sistema Lac, se activa un operón lac en respuesta a la presencia de lactosa, o análogos sintéticos tales como isopropil-b-D-tiogalactósido. Desafortunadamente, el uso de tales sistemas se ve restringido por la química inestable de los ligandos, es decir tetraciclina y lactosa, su toxicidad, su presencia natural o los niveles relativamente altos requeridos para la inducción o represión. Por motivos similares, la utilidad de tales sistemas en animales es limitada.

Moléculas inmunosupresoras tales como FK506, rapamicina y ciclosporina A pueden unirse a inmunofilinas FKBP12, ciclofilina, etc. Usando esta información, se ha ideado una estrategia general para juntar dos cualesquiera proteínas simplemente colocando FK506 en cada una de las dos proteínas o colocando FK506 en una y ciclosporina A en otra. Entonces puede usarse un homodímero sintético de FK506 (FK1012) o un compuesto resultante de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) para inducir la dimerización de estas moléculas (Spencer et al., 1993, Science 262: 1019-24; Belshaw et al., 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93: 4604-7) . Se usaron el dominio de unión a ADN de Gal4 fusionado al dominio activador FKBP12 y VP16 fusionado a ciclofilina, y el compuesto FKCsA, para mostrar la heterodimerización y activación de un gen indicador bajo el control de un promotor que contenía los sitios de unión de Gal4. Desafortunadamente, este sistema incluye inmunosupresores que pueden tener efectos secundarios no deseados y, por tanto, se limita su uso para diversas aplicaciones de interruptor génico en mamíferos.

También se han empleado sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas. Los receptores de hormonas esteroideas son miembros de la superfamilia de receptores nucleares y se encuentran en células de vertebrados e invertebrados. Desafortunadamente, el uso de compuestos esteroideos que activan los receptores para la regulación de la expresión génica, particularmente en plantas y mamíferos, se ve limitada debido a su implicación en muchas otras rutas biológicas naturales en tales organismos. Con el fin de superar tales dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo usando receptores de ecdisona de insectos (EcR) .

El crecimiento, la muda y el desarrollo en insectos se regulan por la hormona esteroidea ecdisona (hormona de la muda) y las hormonas juveniles (Dhadialla, et al., 1998, Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569) . La diana molecular para la ecdisona en insectos consiste en al menos un receptor de ecdisona (EcR) y una proteína ultraespiráculo (USP) . EcR es un miembro de la superfamilia de receptores esteroideos nucleares que se caracteriza por un ADN firma y dominios de unión a ligando, y un dominio de activación (Koelle et al. 1991, Cell, 67:59-77) . Los receptores EcR son sensibles a varios compuestos esteroideos tales como ponasterona A y muristerona A. Recientemente, se han descrito compuestos no esteroideos con actividad agonista de ecdiesteroides, incluyendo los insecticidas disponibles comercialmente tebufenozida y metoxifenozida que se comercializan en todo el mundo por Rohm y Haas Company (véanse la solicitud internacional de patente n.º PCT/EP96/00686 y la patente de EE.UU. 5.530.028) . Ambos análogos tienen perfiles de seguridad excepcionales frente a otros organismos.

El receptor de ecdisona de insecto (EcR) se heterodimeriza con ultraespiráculo (USP) , el homólogo de insectos del RXR de mamíferos, y se une a ecdiesteroides y a elementos de respuesta a receptores de ecdisona y activan la transcripción de genes sensibles a ecdisona (Riddiford et al., 2000) . Los complejos EcR/USP/ligando desempeñan papeles importantes durante la reproducción y el desarrollo de insectos. El EcR es un miembro de la superfamilia de receptores de hormonas esteroideas y tiene cinco dominios modulares, dominios A/B (transactivación) , C (unión a ADN, heterodimerización) ) , D (bisagra, heterodimerización) , E (unión a ligando, heterodimerización y transactivación) y F (transactivación) . Algunos de estos dominios tales como A/B, C y E conservan su función cuando se fusionan con otras proteínas.

Sistemas de expresión génica inducible estrechamente regulados o “interruptores génicos” son útiles para diversas aplicaciones tales como terapia génica, producción a gran escala de proteínas en células, ensayos de selección de alto rendimiento basados en células, genómica funcional y regulación de los rasgos en plantas y animales transgénicos.

La primera versión del interruptor génico basado en EcR usaba EcR de Drosophilia melanogaster (DmEcR) y RXR de Mus musculus (MmRXR) y mostró que estos... [Seguir leyendo]

1. Sistema de modulación de la expresión génica que comprende un casete de expresión génica que puede expresarse en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende:

i) un dominio de transactivación,

ii) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión ha de modularse, y

iii) un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución;

en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H procede de un receptor nuclear de grupo H seleccionado del grupo que consiste en un receptor de ecdisona, un receptor ubicuo, un receptor huérfano 1, un NER-1, un receptor nuclear de hormonas esteroideas 1, una proteína 15 de interacción de receptor retinoide X, receptores hepáticos X 1, una proteína similar al receptor de hormonas esteroideas, un receptor hepático X, un receptor hepático X a, un receptor farnesoide X, una proteína 14 de interacción de receptor, y un receptor de farnesol, en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H se codifica por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido, estando el residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a:

a) residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1,

b) residuos de aminoácido 107 y 175 de SEQ ID NO: 1,

c) residuos de aminoácido 107 y 127 de SEQ ID NO: 1,

d) residuos de aminoácido 107, 127 y 175 de SEQ ID NO: 1, o e) residuos de aminoácido 52, 107 y 175 de SEQ ID NO: 1; y

en el que la (s) mutación/mutaciones por sustitución da (n) como resultado un aumento en la actividad de receptor nuclear de grupo H en respuesta a ligandos esteroideos y no esteroideos, con respecto a la actividad de un receptor nuclear de grupo H en el que el residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido 107 en SEQ ID NO: 1 es valina.

2. Sistema de modulación de la expresión génica según la reivindicación 1, que comprende además un segundo dominio de unión a ligando de receptores nucleares seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de vertebrado, un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de invertebrado, un dominio de unión a ligando de proteína ultraespiráculo, y un dominio de unión a ligando quimérico que comprende dos fragmentos de polipéptido, en el que el primer fragmento de polipéptido procede de un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de vertebrado, un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de invertebrado, o un dominio de unión a ligando de proteína ultraespiráculo, y el segundo fragmento de polipéptido procede de un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de vertebrado, dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de invertebrado, o dominio de unión a ligando de proteína ultraespiráculo diferente.

3. Sistema de modulación de la expresión génica que comprende:

a) un primer casete de expresión génica que puede expresarse en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica para un primer polipéptido que comprende:

i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión ha de modularse, y

ii) un dominio de unión a ligando de receptor nuclear; y

b) un segundo casete de expresión génica que puede expresarse en la célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido que comprende:

i) un dominio de transactivación, y

ii) un dominio de unión a ligando de receptor nuclear;

en el que uno de los dominios de unión a ligando de receptor nuclear es un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución;

en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H procede de un receptor nuclear de grupo H seleccionado del grupo que consiste en un receptor de ecdisona, un receptor ubicuo, un receptor huérfano 1, un NER-1, un receptor nuclear de hormonas esteroideas 1, una proteína 15 de interacción de receptor retinoide X, un receptor hepático X 1, una proteína similar al receptor de hormonas esteroideas, un receptor hepático X, un receptor hepático X a, un receptor farnesoide X, una proteína 14 de interacción de receptor, y un receptor de farnesol;

en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H se codifica por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido, estando el residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a:

a) residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1,

b) residuos de aminoácido 107 y 175 de SEQ ID NO: 1,

c) residuos de aminoácido 107 y 127 de SEQ ID NO: 1,

d) residuos de aminoácido 107, 127 y 175 de SEQ ID NO: 1, o e) residuos de aminoácido 52, 107 y 175 de SEQ ID NO: 1; y

en el que la (s) mutación/mutaciones por sustitución da (n) como resultado un aumento en la actividad de receptor nuclear de grupo H en respuesta a ligandos esteroideos y no esteroideos, con respecto a la actividad de un receptor nuclear de grupo H en el que el residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido 107 en SEQ ID NO: 1 es valina.

4. Sistema de modulación de la expresión génica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución es un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona.

5. Sistema de modulación de la expresión génica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio de unión a ADN se selecciona del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN de receptor de ecdisona, un dominio de unión a ADN de GAL4 y un dominio de unión a ADN de LexA.

6. Sistema de modulación de la expresión génica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el dominio de transactivación se selecciona del grupo que consiste en un dominio de transactivación de receptor de ecdisona, un dominio de transactivación de VP16, un dominio de transactivación de activador ácido B42 y un dominio de transactivación de p65.

7. Casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución;

en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H procede de un receptor nuclear de grupo H seleccionado del grupo que consiste en un receptor de ecdisona, un receptor ubicuo, un receptor huérfano 1, un NER-1, un receptor nuclear de hormonas esteroideas 1, una proteína 15 de interacción de receptor retinoide X, un receptor hepático X 1, una proteína similar al receptor de hormonas esteroideas, un receptor hepático X, un receptor hepático X a, un receptor farnesoide X, una proteína 14 de interacción de receptor, y un receptor de farnesol;

en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H se codifica por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido, estando el residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a:

a) residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1,

b) residuos de aminoácido 107 y 175 de SEQ ID NO: 1,

c) residuos de aminoácido 107 y 127 de SEQ ID NO: 1,

d) residuos de aminoácido 107, 127 y 175 de SEQ ID NO: 1, o e) residuos de aminoácido 52, 107 y 175 de SEQ ID NO: 1; y

en el que la (s) mutación/mutaciones por sustitución da (n) como resultado un aumento en la actividad de receptor nuclear de grupo H en respuesta a ligandos esteroideos y no esteroideos, con respecto a la actividad de un receptor nuclear de grupo H en el que el residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido 107 en SEQ ID NO: 1 es valina.

8. Polinucleótido aislado que codifica para un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución, comprendiendo el polinucleótido aislado una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a: a) residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, b) residuos de aminoácido 107 y 175 de SEQ ID NO: 1, c) residuos de aminoácido 107 y 127 de SEQ ID NO: 1, d) residuos de aminoácido 107, 127 y 175 de SEQ ID NO: 1, e) residuos de aminoácido 52, 107 y 175 de SEQ ID NO: 1, o f) aminoácidos 107, 110 y 175 de SEQ ID NO: 1; y en el que la (s) mutación/mutaciones por sustitución da (n) como resultado un aumento en la actividad de receptor

nuclear de grupo H en respuesta a ligandos esteroideos y no esteroideos, con respecto a la actividad de un receptor

nuclear de grupo H en el que el residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido 107 en SEQ ID NO: 1 es valina.

9. Polinucleótido aislado según la reivindicación 8, en el que la mutación por sustitución es V107l/A110P/R175E de SEQ ID NO: 1.

10. Polinucleótido aislado que codifica para un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona que comprende una mutación por sustitución, en el que el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona carece de actividad de unión a esteroides y el polinucleótido que codifica para el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona se hibrida con un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado la mutación por sustitución V107l/A110P/R175E de SEQ ID NO: 1, en condiciones de hibridación que comprenden una etapa de hibridación en menos de 500 mM de sal y al menos 37 grados Celsius, y una etapa de lavado en 2XSSPE a al menos 63 grados Celsius.

11. Vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado según la reivindicación 8, operativamente unido a un elemento regulador de la transcripción.

12. Célula huésped aislada que comprende el vector de expresión según la reivindicación 11, en la que el elemento regulador de la transcripción es operativo en la célula huésped.

13. Polipéptido aislado codificado por el polinucleótido aislado según la reivindicación 8.

14. Polipéptido aislado que comprende un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución, en el que la mutación por sustitución está en una posición equivalente o análoga a:

a) residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, b) residuos de aminoácido 107 y 175 de SEQ ID NO: 1, c) residuos de aminoácido 107 y 127 de SEQ ID NO: 1, d) residuos de aminoácido 107, 127 y 175 de SEQ ID NO: 1, o e) residuos de aminoácido 52, 107 y 175 de SEQ ID NO: 1; y en el que la (s) mutación/mutaciones por sustitución da (n) como resultado un aumento en la actividad de receptor

nuclear de grupo H en respuesta a ligandos esteroideos y no esteroideos, con respecto a la actividad de un receptor nuclear de grupo H en el que el residuo de aminoácido en el residuo de aminoácido 107 en SEQ ID NO: 1 es valina.

15. Método para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de:

(a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica que comprende un casete de expresión génica que puede expresarse en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende:

i) un dominio de transactivación,

ii) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión ha de modularse, y iii) un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que comprende una mutación por sustitución;

en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H procede de un receptor nuclear de grupo H seleccionado del grupo que consiste en un receptor de ecdisona, un receptor ubicuo, un receptor huérfano 1, un NER-1, un receptor nuclear de hormonas esteroideas 1, una proteína 15 de interacción de receptor retinoide X, receptores hepáticos X 1, una proteína similar al receptor de hormonas esteroideas, un receptor hepático X, un receptor hepático X a, un receptor farnesoide X, una proteína 14 de interacción de receptor, y un receptor de farnesol;

en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H se codifica por un polinucleótido que comprende una mutación de codón que da como resultado una sustitución de un residuo de aminoácido, estando el residuo de aminoácido en una posición equivalente o análoga a:

a) residuo de aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1,

b) residuos de aminoácido 107 y 175 de SEQ ID NO: 1,

c) residuos de aminoácido 107 y 127 de SEQ ID NO: 1,

d) residuos de aminoácido 107, 127 y 175 de SEQ ID NO: 1, o e) residuos de aminoácido 52, 107 y 175 de SEQ ID NO: 1; y

en el que la (s) mutación/mutaciones por sustitución da (n) como resultado un aumento en la actividad de receptor

nuclear de grupo H en respuesta a ligandos esteroideos y no esteroideos, con respecto a la actividad de receptor nuclear de grupo H no mutado, y

(b) introducir en la célula huésped un ligando;

en el que el gen que va a modularse es un componente de un casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN, ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación, y

iii) un gen cuya expresión ha de modularse; mediante lo cual tras la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen de b) iii) . 40 16. Método según la reivindicación 15, en el que el ligando es en la que:

E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-O5) que contiene un carbono terciario;

R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2;

R2 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OK, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COET, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NHCN, o está unido a R3 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidropirilo 55 con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo, o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo; R3 es H, Et, o está unido a R2 y los carbonos de fenilo a los que están unidos R2 y R3 para formar un etilendioxilo, un anillo dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo, o un anillo dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, Cl, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2CI, CH2OH, CN, C=CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe, o SEt; o b) una ecdisona.

2. hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, un oxiesterol, un 22 (R) -hidroxicolesterol, 24 (S) hidroxicolesterol.

2. epoxicolesterol, T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3-sulfato, 7-cetocolesterol-3-sulfato, farnesol, un ácido biliar, un éster de 1, 1-bifosfonato, o una hormona juvenil III.

17. Método según la reivindicación 15 ó 16, que comprende además introducir en la célula huésped un segundo ligando, en el que el segundo ligando es ácido 9-cis-retinoico o un análogo sintético de un ácido retinoico.

18. Célula huésped aislada que comprende el sistema de modulación de la expresión génica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. Organismo no humano que comprende la célula huésped según la reivindicación 18.

20. Sistema de modulación de la expresión génica según la reivindicación 1, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I, V107I/R175E, V107I/Y127E, V107I/Y127E/R175E o T52V/V107I/R175E de SEQ ID NO: 1.

21. Sistema de modulación de la expresión génica según la reivindicación 3, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I, V107I/R175E, V107I/Y127E, V107I/Y127E/R175E o T52V/V107I/VR175E de SEQ ID NO: 1.

22. Polinucleótido aislado según la reivindicación 8, en el que la mutación de codón da como resultado una mutación por sustitución, mutación por sustitución V107I, V107I/R175E, V107I/Y127E, V107I/Y127E/R175E o T52V/V107I/R175E de SEQ ID NO: 1.

23. Polipéptido aislado según la reivindicación 14, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I, V107l/R175E, V107I/Y127E, V107I/Y127E/R175E o T52V/V107I/R175E de SEQ ID NO: 1.

24. Sistema de modulación de la expresión génica según la reivindicación 1, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1.

25. Sistema de modulación de la expresión génica según la reivindicación 3, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1.

26. Polinucleótido aislado según la reivindicación 8, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I//Y127E de SEQ ID NO: 1.

27. Polipéptido aislado según la reivindicación 14, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1.

28. Casete de expresión génica según la reivindicación 7, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I, V107I/R175E, V107I/Y127E, V107I/Y127E/R175E o T52V/V107I/R175E de SEQ ID NO: 1.

29. Casete de expresión génica según la reivindicación 28, en el que la mutación por sustitución es una mutación por sustitución V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1.

30. Vector que comprende el sistema de modulación de la expresión génica según las reivindicaciones 1-6, 20, 21, 24 ó 25, el polinucleótido aislado según las reivindicaciones 8-10, 22 ó 26, o el casete de expresión génica según las reivindicaciones 7, 28 ó 29.

31. Célula huésped aislada que comprende el vector según la reivindicación 30.

32. Método según la reivindicación 15, que comprende además un segundo dominio de unión a ligando de receptor nuclear seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de vertebrado, un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de invertebrado, un dominio de unión a ligando de proteína ultraespiráculo, y un dominio de unión a ligando quimérico que comprende dos fragmentos de polipéptido, en el que el primer fragmento de polipéptido procede de un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de vertebrado, un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de invertebrado, o un dominio de unión a ligando de proteína ultraespiráculo, y el segundo fragmento de polipéptido procede de un dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de vertebrado diferente, dominio de unión a ligando de receptor retinoide X de invertebrado, o dominio de

unión a ligando de proteína ultraespiráculo.

33. Método según la reivindicación 15, en el que el dominio de unión a ligando de receptor nuclear de grupo H que

comprende una mutación por sustitución es un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona. 5

34. Método según la reivindicación 15, en el que el dominio de unión a ADN se selecciona del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN de receptor de ecdisona, un dominio de unión a ADN de GAL4, y un dominio de unión a ADN de LexA.

35. Método según la reivindicación 15, en el que el dominio de transactivación se selecciona del grupo que consiste en un dominio de transactivación de receptor de ecdisona, un dominio de transactivación de VP16, un dominio de transactivación de activador ácido B42, y un dominio de transactivación de p65.