Quimera de ADN polimerasa del fago phi 29.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología.

Específicamente, se refiere a una quimera de ADN polimerasa que comprende una región amino-terminal (N-terminal), que codifica para una ADN polimerasa del tipo f29, y una región carboxilo-terminal (C-terminal), que comprende, al menos, un dominio HhH, que se encuentran unidas mediante una secuencia aminoacídica conectora y a su uso para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. Asimismo, la presente invención proporciona un método para llevar a cabo la replicación, la amplificación o la secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con dicha quimera de ADN polimerasa y un kit para llevar a cabo dicho método.

Quimera de ADN polimerasa del fago φ29.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a una quimera de ADN polimerasa que comprende una región amino-terminal (N-terminal) , que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, y una región carboxilo-terminal (C-terminal) , que comprende, al menos, un dominio HhH, que se encuentran unidas mediante una secuencia de aminoácidos enlazados y a su uso para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. Asimismo, la presente invención proporciona un método para llevar a cabo la replicación, la amplificación o la secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con dicha quimera de ADN polimerasa y un kit para llevar a cabo dicho método.

Estado de la técnica anterior

La única enzima requerida por el bacteriófago φ29 para replicar su genoma es su ADN polimerasa, una proteína monomérica de 66 KDa, capaz de catalizar tanto la iniciación de la replicación como la elongación de la cadena sintetizada. Para la iniciación, esta polimerasa se une a una proteína denominada "terminal" (TP) , reconoce el extremo del ADN de φ29 y cataliza la formación de un complejo covalente TP-dAMP. Tras la polimerización de 10 nucleótidos, se disocia el heterodímero ADN polimerasa/TP y se lleva a cabo la elongación de la cadena naciente de ADN.

Las ADN polimerasas replicativas requieren la interacción con proteínas accesorias que estabilizan la unión entre la enzima y el ADN (Kuriyan y O'Donnell. J Mol Biol. 1993; 234: 915-925) . Por otro lado, dichas ADN polimerasas necesitan acoplar la polimerización al desplazamiento de la cadena de ADN que no está siendo copiada, para lo cual

requieren su asociación funcional a proteínas tipo helicasa. En este sentido, la ADN polimerasa del bacteriófago φ29

presenta varias características funcionales intrínsecas que la hacen única:

a) Elevada procesividad (definida como el número de nucleótidos incorporados por la reacción o efecto enlazante) . b) Alta capacidad de desplazamiento o separación de hélice o cadena, lo que le permite replicar el genoma de dicho bacteriófago en ausencia de proteínas accesorias tipo helicasa. Estas dos características, procesividad y desplazamiento de cadena permiten que la ADN polimerasa de φ29 sea capaz de sintetizar cadenas o hélices de ADN de más de 70 kb de longitud (Blanco et al. J Biol Chem. 1989; 264: 8935-8940) . c) Elevada precisión en la inserción de nucleótidos en la nueva cadena (Esteban et al. J Biol Chem. 1993; 268: 27192726) .

Todas estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos de procesos isotérmicos (a temperatura constante) para la amplificación del ADN de doble cadena (ADN bc) , basados en el uso de esta polimerasa. En una configuración simple, la capacidad de la ADN polimerasa de φ29 para usar ADN de cadena sencilla (ADNmc) circular permite una amplificación de ADN por el método del circulo rodante (o, RCA de las siglas en inglés de rolling-circle amplification) , originando moléculas de ADNmc de gran longitud y que contienen más de 10 copias del molde circular (Blanco et al. J Biol Chem. 1989; 264: 8935-8940; US5001050, US5198543 y US5576204) . En el procedimiento de amplificación de ADNbc desarrollado por Amersham Biosciences/Molecular Staging (Dean et al. Genome Res. 2001; 11: 1095-1099; Dean et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 5261-5266) , la combinación del uso de la ADN polimerasa de φ29 con el de hexámeros (hexa-nucleótidos) cebadores de secuencias al azar, permiten obtener factores de amplificación de 104-106 partiendo de picogramos de ADN plasmídico circular [TempliphiTM de GE Healthcare] o de 10 nanogramos de ADN genómico [GenomiphiTM de GE Healthcare y Repli-G® de Qiagen]. Los productos originados son de alta calidad y pueden digerirse o ser secuenciados directamente sin necesidad de purificación previa, habiéndose demostrado que la ADN polimerasa de φ29 es la enzima más robusta para este fin. El tampón habitual para llevar a cabo las reacciones de amplificación con la ADN polimerasa de φ29 contiene Tris-HCl (pH 7, 5) más distintas concentraciones (en el orden milimolar) de NaCl o KCl y MgCl2 (US20030207267) . Sin embargo, a pesar de la bondad de estos protocolos en situaciones muy diversas, es una necesidad creciente el desarrollar otros que permitan partir de cantidades menores de ADN.

Los motivos HhH ("hélice-gancho-hélice") unen el ADN independientemente de su secuencia y se encuentran en diversas ADN polimerasas, ligasas y glicosilasas (Shao y Grishin. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2643-2650; Doherty et al. Nucleic Acids Res. 1996; 24:2488-2497) . Estos motivos contienen un par de α-hélices antiparalelas conectadas por un lazo tipo "horquilla o gancho". La segunda α-hélice no sobresale de la estructura y por lo tanto, a diferencia de otros motivos de unión al ADN, no puede intercalarse en el surco mayor del ADN. Los estudios cristalográficos sugieren que las interacciones proteína-ADN se establecen a través del "lazo" entre las dos αhélices. Este lazo está implicado en el establecimiento de interacciones inespecíficas con el ADN, y normalmente contiene la secuencia consenso GhG, donde h es un residuo hidrofóbico, normalmente I, V, o L. La resolución de estructuras cristalográficas sugiere que las interacciones se establecen entre los nitrógenos de la cadena polipeptídica y los oxígenos de los fosfatos del ADN. Además, en las posiciones 2 y 3 respecto a la segunda G suelen existir aminoácidos polares que establecerían interacciones adicionales con los grupos fosfato. La última G de la secuencia consenso constituye la parte N-terminal de la segunda α-hélice, y el residuo hidrofóbico h contribuye a las interacciones entre las dos α-hélices del motivo. Las dos α-hélices se encuentran empaquetadas formando entre sí un ángulo de 25-50º que dicta el patrón característico de hidrofobicidad en las secuencias. Los motivos HhH generalmente forman parte de estructuras mayores denominadas (HhH) 2, compuestas por dos motivos HhH unidos por una hélice α, formando una simetría especular respecto a la del ADN que facilita su unión estable al mismo (Shao y Grishin. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2643-2650; Doherty et al. Nucleic Acids Res. 1996; 24:2488-2497; Thayer et al. EMBO J. 1995; 14: 4108-4120) .

La formación de quimeras entre ADN polimerasas termoestables como Taq y Pfu y motivos que unen ADN de manera no específica se ha utilizado anteriormente para aumentar la capacidad de unión al ADN por dichas polimerasas. (Pavlov et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 13510-13515; WO2004013279; Wang et al. Nucleic Acids Res. 2004; 32: 1197-1207) .

La resolución cristalográfica de la estructura de la ADN polimerasa de φ29 ha proporcionado las bases moleculares responsables de la polimerización procesiva acoplada al desplazamiento de cadena, una característica específica de esta enzima (Kamtekar et al. 2006; EMBO J 25: 1335-1343) .

El análisis comparativo con otras ADN polimerasas del tipo eucariótico (familia B) muestra un plegamiento general similar: un dominio de polimerización C-terminal constituido por los subdominios universales dedos, palma y pulgar, y que forman un canal a través del cual se une el ADN; y un dominio exonucleasa 3'-5' N-terminal responsable de eliminar los nucleótidos incorporados erróneamente durante la polimerización. La principal diferencia estructural entre las ADN polimerasas de estructura conocida y la de φ29 es la presencia en esta última de dos subdominios adicionales en su dominio de polimerización, ambos correspondientes a inserciones de secuencia conservadas en el subgrupo de las ADN polimerasas que utilizan una proteína como iniciador, llamados TPR1 y TPR2. El subdominio TPR1 se encuentra situado junto al palma y contacta con el dúplex ADN. El subdominio TPR2, con una estructura de β-gancho o horquilla, forma, junto a los subdominios pulgar, palma y dedos una estructura anular que rodearía por completo el ADN de nueva síntesis, estabilizando la unión de la ADN polimerasa al ADN, requerida para replicar de manera procesiva. Asimismo, el subdominio TPR2 participa junto con los subdominios dedos, palma y el dominio exonucleasa en la formación de un canal estrecho por el que pasa la cadena molde para acceder al centro activo durante la replicación, forzando la separación de la doble cadena de ADN a medida que la polimerasa se va desplazando, actuando de manera análoga a como lo haría una helicasa y proporcionando a la polimerasa su capacidad de acoplar la polimerización al desplazamiento de cadena (Kamtekar et al. 2006; EMBO J 25: 1335-1343; Rodríguez... [Seguir leyendo]

1. Quimera de ADN polimerasa que comprende:

una secuencia de aminoácidos que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29 (a) , enlazada por su extremo Cterminal a una secuencia de aminoácidos conectados (b) enlazada por su extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos que comprende, al menos, un dominio hélice-gancho-hélice (HhH) (c) .

2. La quimera de ADN polimerasa conforme a la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos de (c) comprende, al menos, un dominio HhH de una proteína que se selecciona de la lista que comprende:

- topoisomerasa V de Methanopyrus Kandleri,

- MutY, Nth, MutM/Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE o DnlJ de Escherichia coli,

- RAD1, RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1, OGG1, NTG1, NTG2, DIN-7 o EXO-1 de levaduras, o

-una proteína homologa de las anteriores en Bacillus subtilis, Caernorhabditis elegans, Haemophilus influenzae, Methanococcus jannaschii, Micrococcus luteus, Methanobacterium thermoformicum o Salmonella typhimurium.

3. La quimera de ADN polimerasa conforme a la reivindicación 2, donde la secuencia de aminoácidos de (c) comprende, al menos, un dominio HhH derivado de la topoisomerasa V de Methanopyrus kandleri.

4. La quimera de ADN polimerasa conforme a la reivindicación 3, donde la secuencia de aminoácidos de (c) es SEQ ID NO: 3.

5. La quimera de ADN polimerasa conforme a la reivindicación 3, donde la secuencia de aminoácidos de (c) es SEQ ID NO: 3 enlazada por su extremo C-terminal a la SEQ ID NO:4.

6. La quimera de ADN polimerasa conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia de aminoácidos conectados (b) es SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO:6.

7. La quimera de ADN polimerasa conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) se selecciona entre las ADN polimerasas aisladas de los siguientes fagos: φ29, Cp-1, PRD-1, φ15, φ21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 o ABV.

8. La quimera de ADN polimerasa conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la ADN polimerasa

del tipo φ29 de (a) tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 80% con SEQ ID

NO:1.

9. La quimera de ADN polimerasa conforme a la reivindicación 8, donde la ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1.

10. La quimera de ADN polimerasa conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) tiene una modificación en el dominio de la exonucleasa y donde dicha ADN polimerasa modificada tiene menos de un 10% de actividad de la exonucleasa que la ADN polimerasa correspondiente de origen natural.

11. La quimera de ADN polimerasa conforme a la reivindicación 10, donde la ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) tiene menos del 1% de la actividad de la exonucleasa que la correspondiente ADN polimerasa de origen natural.

12. La quimera de ADN polimerasa conforme a reivindicación 11, donde la ADN polimerasa del tipo φ29 modificada de (a) carece de actividad detectable de la exonucleasa con respecto a la correspondiente ADN polimerasa de origen natural.

13. Uso de la quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde.

14. Método de replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos:

a) la quimera de ADN polimerasa de la invención, b) un tampón, c) cloruro magnésico, d) un cebador, y

e) nucleósido trifosfatos.

15. Método según la reivindicación 14, donde la mezcla de reacción además comprende monolaurato de sorbitán polioxietilenado

16. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, donde la mezcla de reacción comprende además una sal de amonio.

17. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde la mezcla de reacción comprende además una sal de potasio.

18. Método conforme a la reivindicación 17, donde la sal de potasio es cloruro de potasio o acetato de potasio.

19. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción entre el 0, 003% y el 0, 1% del volumen total de la reacción.

20. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde la sal de amonio se selecciona de la lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio o acetato de amonio.

21. Método conforme a la reivindicación 20, donde la sal de amonio es sulfato de amonio.

22. Método conforme a la reivindicación 21, donde el sulfato de amonio se encuentra en una concentración entre 30 mM y 60 mM.

23. Método conforme a la reivindicación 20, donde la sal de amonio es cloruro de amonio o acetato de amonio.

24. Método conforme a la reivindicación 23, donde el cloruro de amonio o el acetato de amonio se encuentra en una concentración entre 60 mM y 120 mM.

25. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 24, donde el tampón es tris-clorhídrico, tris-acético o HEPES.

26. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, donde el tampón equivale a un PH entre 7, 0 y 8, 5.

27. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 26, donde el cloruro magnésico está en una concentración entre2 mM y 20 mM.

28. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, donde el cloruro magnésico o el acetato potásico se encuentra en una concentración entre 30 mM y 70 mM.

29. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 28, donde los nucleósido trisfosfatos son dCTP, dGTP, dTTP y dATP.

30. Método conforme a la reivindicación 29, donde los nucleósido trisfosfatos dCTP, dGTP, dTTP y dATP están en cantidades equimolares.

31. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 30, donde el cebador es arbitrario y está protegido frente a la acción de las exonucleasas.

32. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 31, donde el ADN patrón es el ADN plasmídico o el ADN genómico.

33. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 32, donde la amplificación se realiza a una temperatura esencialmente constante entre 25 y 40º C.

34. Método para ampliar un ADN patrón conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 33, donde la amplificación tiene lugar mediante amplificación por círculo rodante (RCA) , amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) , amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) o amplificación mediante lazo (LAMPA) .

35. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 34, donde al menos un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado.

36. Kit para llevar a cabo un método conforme a las reivindicaciones 14 a 35 que comprende: a) la quimera de ADN polimerasa conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, b) un tampón, y c) cloruro de magnesio.

37. Kit conforme a la reivindicación 36, que comprende además monolaurato de sorbitán polioxietilenado.

38. Kit conforme a cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 37, que comprende además una sal de amonio.

39. Kit conforme a cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, que comprende además una sal de potasio.

40. Kit conforme a cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 39, que comprende además un cebador.

41. Kit conforme a cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, que comprende además el cebador conforme a la reivindicación 31.

42. Kit conforme a cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, que comprende además los nucleósido trifosfatos.

43. Kit conforme a cualquiera de las reivindicaciones 36 a 42, donde al menos un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado.

Tampón A Tampón A Tampón A Tampón A

0, 025% Tween 0, 025% Tween 45mM SO4 (NH4) 2

45mM SO4 (NH4) 2

ADN aportado, fg

Figura 1

Figura 2

Sal de amonio Sulfato de amonio Cloruro de amonio Acetato de amonio (45mM) (90mM) (90mM) ADN aportado, fg 0 0, 1 1 10 0 0, 1 1 10 0 0, 1 1 10

ADN polimerasa del tipo φ29 natural Complejo ADNpol/ADN ADN libre