Proteína con la actividad de la enzima biosintética piretrina, gen codificador de la proteína y vector portador del gen.

Método para producir una enzima biosintética de piretrina de una proteína con un peso molecular de aproximadamente 40.

000, donde la materia prima de la enzima es una solución enzimática cruda preparada a partir de una flor de piretro;

donde se utiliza (1R)-trans-crisantemoil-CoA y (S)-piretrolona como sustratos para una ensayo que confirma una función activa de la enzima biosintética del piretro;

donde la enzima biosintética de piretro se produce mediante un procedimiento de purificación que incluye los pasos secuenciales de:

obtener un precipitado de fraccionamiento de proteína cruda con precipitación de sulfato de amonio;

someter el precipitado a una purificación cruda mediante un método por lotes utilizando una resina hidrófoba;

purificar la solución enzimática obtenida mediante la purificación cruda por cromatografía de intercambio aniónico;

purificar por cromatografía hidrófoba; y

purificar por filtración en gel.

Proteína con la actividad de la enzima biosintética piretrina, gen codificador de la proteína y vector portador del gen

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a una proteína que tiene la actividad de la enzima biosintética piretrina, a un gen codificador de la proteína y a un vector que porta el gen.

ANTECEDENTES TÉCNICOS

La piretrina, un metabolito secundario contenido en el piretro, tiene una excelente actividad insecticida contra insectos, siendo una característica ideal como constituyente insecticida que su toxicidad para los mamíferos es baja, y se utiliza ampliamente en espirales anti-mosquitos y en espráis y polvos insecticidas. Recientemente, la demanda de piretrina ha disminuido debido al extraordinario desarrollo de los piretroides sintéticos. Sin embargo, la piretrina sigue teniendo un alto valor útil como material vegetal respetuoso con el medio ambiente para insecticidas y se han seguido las investigaciones para poder obtener piretrina de forma económica y eficaz. En particular, el valor de existencia de la piretrina arriba indicada, un metabolito secundario, se ha acentuado de nuevo debido al aumento del precio del aceite, que es una materia prima de los piretroides sintéticos, y similares.

La piretrina se extrae fundamentalmente de la parte de la flor del piretro. Sin embargo, el tiempo de crecimiento del piretro hasta su floración es muy largo, más de tres años. Se considera que la selección y el cultivo de cepas de alta producción de piretro y la promoción de la biosíntesis de piretrina en células vegetales de la misma especie o de especies diferentes tienen un efecto beneficioso como medio para aumentar la eficiencia de la producción de piretrina.

La piretrina tiene una estructura con un enlace éster entre el ácido crisantémico, que es un ácido carboxílico de monoterpeno, y retrolonas (alcoholes) , que son un metabolito de la oxidación de ácidos grasos (Fig. 3) . Es sabido que en la biosíntesis de piretrina se biosintetizan ácido crisantémico y retrolonas en diferentes vías metabólicas y finalmente se forma un enlace éster entre éstos.

Los métodos para aumentar la eficiencia de la biosíntesis de piretrina arriba descrita incluyen el uso de genes que intervienen en la biosíntesis. Para llevar a cabo la biosíntesis de la piretrina es crucial aislar e identificar el gen pertinente.

Entre tanto, diversos compuestos éster producidos por células vegetales se biosintetizan mediante catálisis de aciltransferasa a partir de CoA tioéster de ácido carboxílico (acil- CoA, RCO-S- CoA) y alcohol (R'-OH) como sustratos (Fig. 4) , estas biosíntesis se describen, por ejemplo, en los Documentos No de Patente 1 y 2.

Como ejemplo de tal aciltransferasa en la biosíntesis de la piretrina se ha predicho la existencia de crisantemoil/piretroil-transfersasa (enzima biosintética de piretrina) que utiliza (1R) -trans-crisantemoil-CoA y (S) piretrolona como sustratos; sin embargo ésta no se ha aislado y no se ha buscado una composición específica basada en una secuencia de aminoácidos ni en ningún gen natural codificador de la proteína basada en una secuencia de aminoácidos de este tipo.

La Publicación de Solicitud de Patente Japonesa nº H9-504684 describe una secuencia de aminoácidos de crisantemil-difosfato-sintasa, una enzima que puede catalizar la síntesis de crisantemil difosfato, que se utiliza como materia prima para la síntesis química de piretrina, así como una secuencia de un gen codificador de una proteína basada en dicha secuencia de aminoácidos. Sin embargo, no existe ninguna divulgación ni sugerencia sobre el gen codificador de la enzima per se que puede catalizar la biosíntesis de piretrina arriba indicada, ni del gen codificador de la proteína basada en dicha secuencia de aminoácidos. Tal como es obvio por el estado de la técnica convencional, hasta ahora no se ha logrado elucidar el gen codificador de la proteína de la enzima arriba indicada mediante la identificación de la enzima que interviene en la biosíntesis de piretrina, ni la biosíntesis efectiva de piretrina basada en conocimientos de ingeniería genética.

Documento de Patente 1: Publicación de solicitud de patente japonesa nº H9-504684

Documento No de Patente 1: R. Kalscheuer y A. Steinbuchel, A novel bifunctional wax ester synthase/acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase mediates wax ester and triacylglycerol biosynthesis in Acinetobacter calcoaceticus ADP1. J. Biol. Chem. 278:8075-8082 (2003)

Documento No de Patente 2: J. Luo y col., Convergent evolution in the BAHD family of acyl transferases: identification and characterization of anthocyanin acyl transferases from Arabidopsis thaliana. Plant J. 50:678-695 (2007)

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Y PROBLEMAS A RESOLVER POR LA MISMA

La presente invención tiene el objetivo de determinar secuencias de aminoácidos de la enzima que interviene en la biosíntesis de la piretrina y una secuencia de bases del gen de la misma, construir vectores que porten el gen y transformantes, así como proporcionar métodos para producir la piretrina eficazmente mediante la aplicación de estas técnicas creativas a plantas de crecimiento más rápido.

Para resolver las cuestiones arriba indicadas, los presentes inventores han purificado una proteína de la enzima de síntesis de piretrina utilizando la flor de piretro como material de partida y la actividad de síntesis de piretrina I como indicador, y llevando a cabo un fraccionamiento de una proteína y una purificación cruda mediante un método en lotes utilizando una resina hidrófoba, y después una purificación con una combinación predeterminada de cromatografía; y finalmente han analizado una secuencia de aminoácidos interna y una secuencia amino terminal de la proteína pertinente tal como se describe más abajo. Se ha llevado a cabo una RACE-PCR y se ha amplificado un fragmento de polinucleótido de una parte desconocida de la secuencia utilizando una librería de ADNc obtenida de una parte de la flor del piretro como cebadores temperados y degenerados diseñados en base a las secuencias de aminoácidos crudas, que han sido clarificadas mediante los análisis arriba indicados.

Se ha analizado un fragmento de polinucleótido amplificado de la secuencia de bases con un secuenciador de ADN. Como resultado, se ha determinado una secuencia genética de longitud completa de una enzima biosintética de piretrina, incluyendo la secuencia mostrada en la Fig. 2, es decir, la Secuencia nº 5, y una secuencia de aminoácidos codificada por el gen, secuencia mostrada en la Fig. 1 (a) , es decir, la Secuencia nº 1. La presente invención se ha completado en base a dicha determinación de las secuencias.

La presente invención adopta la siguiente constitución:

(1) Un método para producir una enzima biosintética de piretrina de una proteína con un peso molecular de aproximadamente 40.000, siendo el material de partida de la enzima una solución enzimática cruda preparada a partir de flor de piretro; donde la enzima biosintética de piretro se obtiene mediante un procedimiento de purificación que incluye los pasos secuenciales de:

obtener un precipitado del fraccionamiento de la proteína cruda con precipitación de sulfato de amonio; someter el precipitado a una purificación cruda mediante un método por lotes utilizando una resina hidrófoba; purificar la solución enzimática obtenida por la purificación cruda mediante cromatografía de intercambio aniónico; purificar mediante cromatografía hidrófoba; y purificar mediante filtración por gel;

y donde la enzima producida es una proteína con un peso molecular de aproximadamente 40.000.

(2) Una de las siguientes proteínas (i) o (ii) , correspondiente a una enzima extraíble de cuerpos de plantas productoras de piretrina:

(i) una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 1; o

(ii) una proteína consistente en una secuencia de aminoácidos que incluye una o más modificaciones consistentes en sustitución, deleción, inserción y/o adición de un aminoácido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 1, presentando la proteína la actividad de una enzima biosintética de piretrina.

(3) Una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 2, o una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 3, o una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 4, correspondientes a una enzima extraíble de cuerpos de plantas productoras de piretrina.

(4) Un gen codificador de una de las siguientes proteínas (i) o (ii) , correspondiente a una... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una enzima biosintética de piretrina de una proteína con un peso molecular de aproximadamente 40.000, donde la materia prima de la enzima es una solución enzimática cruda preparada a partir de una flor de piretro;

donde se utiliza (1R) -trans-crisantemoil-CoA y (S) -piretrolona como sustratos para una ensayo que confirma una función activa de la enzima biosintética del piretro;

donde la enzima biosintética de piretro se produce mediante un procedimiento de purificación que incluye los pasos secuenciales de:

obtener un precipitado de fraccionamiento de proteína cruda con precipitación de sulfato de amonio;

someter el precipitado a una purificación cruda mediante un método por lotes utilizando una resina hidrófoba;

purificar la solución enzimática obtenida mediante la purificación cruda por cromatografía de intercambio aniónico;

purificar por cromatografía hidrófoba; y

purificar por filtración en gel.

2. Una de las siguientes proteínas (i) o (ii) , correspondiente a una enzima extraíble de cuerpos de plantas productoras de piretrina:

(i) una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 1; o

(ii) una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos que incluye una o más de las modificaciones consistentes en sustitución, deleción, inserción y/o adición de un aminoácido en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 1, presentando la proteína la actividad de una enzima biosintética de piretrina, utilizándose (1R) -trans-crisantemoil-CoA y (S) -piretrolona como sustratos para un ensayo para confirmar la función activa de la enzima biosintética del piretro.

3. Proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 2, o proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 3, o proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 4, correspondientes a una enzima extraíble de cuerpos de plantas productoras de piretrina.

4. Gen codificador de una de las siguientes proteínas (i) o (ii) , correspondiente a una enzima extraíble de cuerpos de plantas productoras de piretrina:

(i) una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 1; o

(ii) una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos que incluye una o más de las modificaciones consistentes en sustitución, deleción, inserción y/o adición de un aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 1, presentando la proteína la actividad de una enzima biosintética de piretrina, utilizándose (1R) -trans-crisantemoil-CoA y (S) -piretrolona como sustratos para una prueba para confirmar la función activa de la enzima biosintética de piretro.

5. Gen según la reivindicación 4, que consiste en la secuencia de bases mostrada en la Secuencia nº 5; codificando el gen la proteína de (i) .

6. Gen según la reivindicación 5, que incluye la secuencia de bases de 85 a 1.179 de la secuencia de bases mostrada en la Secuencia nº 5 como marco de lectura abierto.

7. Gen codificador de cualquiera de las siguientes proteínas: una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 2, o una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 3, o una proteína consistente en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Secuencia nº 4, correspondiente a una enzima extraíble de cuerpos de plantas productoras de piretrina.

8. Vector que porta un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

Secuencia nº 1

Secuencia nº 2

Secuencia nº 3

Secuencia nº 4 Secuencia nº 5