Prolil endopeptidasa (PEP) y glutamina endoproteasa para el tratamiento de la celiaquía.

Formulación para utilizar en el tratamiento de la celiaquía que comprende una prolil endopeptidasa (PEP) y unaglutamina endoproteasa,

junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Prolil endopeptidasa (PEP) y glutamina endoproteasa para el tratamiento de la celiaquía [0001] En 1953 se reconoció por primera vez que la ingestión de gluten, una proteína alimenticia común presente en trigo, cebada y centeno, producía una enfermedad en individuos sensibles. El gluten es una mezcla compleja de glutenina rica en glutamina y prolina y moléculas de prolamina, que se cree que es responsable de la inducción de enfermedad. La ingestión de tales proteínas por individuos sensibles produce un aplanamiento del revestimiento epitelial similar a alfombra normalmente lujoso del intestino delgado que se sabe que es responsable de la eficaz y extensa digestión terminal de péptidos y otros nutrientes. Los síntomas clínicos de la celiaquía incluyen fatiga, diarrea crónica, intolerancia de nutrientes, pérdida de peso, distensión abdominal, anemia, además de un riesgo sustancialmente aumentado del desarrollo de osteoporosis y tumores malignos intestinales (linfoma y carcinoma) . La enfermedad tiene una incidencia de aproximadamente 1 de cada 200 en poblaciones europeas [0002] Una enfermedad relacionada es la dermatitis herpetiforme, que es una erupción crónica caracterizada por grupos de vesículas intensamente pruríticas, pápulas y lesiones similares a urticaria. Los depósitos de IgA se producen en casi toda la piel de aspecto normal y perilesional. La enteropatía asintomática sensible al gluten se encuentra en el 75 al 90% de los pacientes y en algunos de sus parientes. La aparición es normalmente gradual. El picor y el escozor son intensos, y el rascarse frecuentemente oculta las lesiones primarias con eczematización de piel cercana, conduciendo a un diagnóstico erróneo de eczema. El estricto cumplimiento de una dieta sin gluten durante periodos prolongados puede controlar la enfermedad en algunos pacientes, obviando o reduciendo el requisito de farmacoterapia. Algunas veces se recetan dapsona, sulfapiridina y colchicinas para aliviar el picor.

Generalmente se considera que la celiaquía es una enfermedad autoinmunitaria y los anticuerpos encontrados en el suero de los pacientes apoyan la teoría de una naturaleza inmunológica de la enfermedad. Los anticuerpos para la transglutaminasa de tejido (tTG) y la gliadina aparecen en casi el 100% de los pacientes con celiaquía activa, y la presencia de tales anticuerpos, particularmente de la clase IgA, se ha usado en el diagnóstico de la enfermedad.

La gran mayoría de los pacientes expresa las moléculas HLA-DQ2 [DQ (a1*0501, b1*02) ] y/o DQ8 [DQ (a1*0301, b1*0302) ]. Se cree que la lesión intestinal se produce por interacciones entre oligopéptidos de gliadina específicos y el antígeno HLA-DQ2 o DQ8, que a su vez inducen la proliferación de linfocitos T en las capas subepiteliales. Los linfocitos auxiliares T1 y las citocinas desempeñan aparentemente una función principal en un proceso inflamatorio local que conduce a atrofia vellositaria del intestino delgado [0005] Actualmente no hay una buena terapia para la enfermedad, excepto evitar completamente todos los alimentos que contengan gluten. Aunque la eliminación del gluten ha transformado el pronóstico para niños y lo ha mejorado sustancialmente para adultos, algunas personas todavía mueren de la enfermedad, principalmente adultos que tenían una enfermedad grave desde el principio. Una causa importante de muerte es la enfermedad linforreticular (especialmente linfoma intestinal) . No se sabe si una dieta sin gluten disminuye este riesgo. La remisión clínica aparente está frecuentemente asociada a una recaída histológica que sólo se detecta por biopsias de revisión o por un aumento de los títulos de EMA

El gluten se usa tan ampliamente, por ejemplo, en sopas comerciales, salsas, helados, perritos calientes y otros alimentos que los pacientes necesitan listas detalladas de productos alimenticios para evitarlos y consejo experto de un dietista familiarizado con la enfermedad celíaca. La ingestión de incluso pequeñas cantidades de gluten puede evitar la remisión o inducir recaída. También pueden requerirse vitaminas complementarias, minerales y antianémicos, dependiendo de la deficiencia. Algunos pacientes responden mal o no responden a la eliminación del gluten, tanto debido a que el diagnóstico es incorrecto como debido a que la enfermedad es resistente al tratamiento. En el último caso, los corticosteroides orales (por ejemplo, prednisona 10 a 20 mg dos veces al día) pueden inducir respuesta [0007] WO 03/068170 se refiere a la administración de una dosis eficaz de glutenasa a un paciente celíaco o con dermatitis herpetiforme para reducir los niveles de oligopéptidos de gluten tóxicos, atenuando o eliminando así los efectos dañinos del gluten.

En vista de la naturaleza grave y extendida de la celiaquía, se necesitan procedimientos mejorados para tratar o mejorar los efectos de la enfermedad. La presente invención trata tales necesidades.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una formulación para utilizar en el tratamiento de la celiaquía, que comprende una prolil endopeptidasa (PEP) y una glutamina endoproteasa, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. La PEP puede ser PEP de Flavobacterium meningosepticum, PEP de Myxococcus xanthus, PEP de Sphingomonas capsulata, o Penicillium citrinum. La glutamina endoproteasa puede ser cisteína proteasa B de Hordeum vulgare.

Aspectos adicionales de la invención se establecen en las reivindicaciones que se acompañan.

En el presente documento se describe PEP de Myxococcus xanthus purificado, fragmentos biológicamente activos o derivados de los mismos; y formulaciones farmacéuticas de los mismos. La enzima se puede expresar en una célula huésped heteróloga, por ejemplo, una bacteria heteróloga y purificarse mediante cromatografía de afinidad. Se observa que la enzima se puede purificar, liofilizar y formular en dosis unitarias, tales como comprimidos, cápsulas con recubrimiento entérico, etc., a la vez que mantiene sustancialmente la actividad biológica. Las formulaciones de interés incluyen formulaciones en las que la enzima está contenida en un recubrimiento entérico que permite la liberación del agente activo al intestino y formulaciones en las que los agentes activos se estabilizan para resistir la digestión en las condiciones ácidas del estómago. La formulación puede comprender una o más enzimas o una mezcla o “cóctel” de agentes que tienen actividades diferentes.

La presente invención se describe a continuación con mayor detalle.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Efecto del pH en los números de recambio (kcat) de PEP de FM, PEP de MX y PEP de SC.

Figura 2. Resistencia de la PEP de FM y la PEP de MX a la inactivación por las enzimas gástricas y pancreáticas. La estabilidad de las enzimas pancreáticas se evaluó mediante el tratamiento de 5 U/ml de la PEP de FM y la PEP de MX con 1 mg/ml de tripsina, 1 mg/ml de quimiotripsina, 0, 2 mg/ml de elastasa y 0, 2 mg/ml de carboxipeptidasa A (fosfato 40 mM, pH=6, 5) . La estabilidad de pepsina se evaluó mediante el tratamiento de la PEP de FM y la PEP de MX (5 U/ml) con 1 mg/ml de pepsina (pH=2, HCl 20 mM) .

Figura 3. Especificidad de sitio de la hidrólisis de PQPQLPYPQPQLP por PEP individuales. Se muestran las trazas de HPLC-UV (215 nm) para cada mezcla de reacción. Los fragmentos de la separación inicial (100 μM (SEQ ID NO: 11) PQPQLPYPQPQLP, enzima 0, 1 mM, t = 5 min) se identificaron mediante espectrometría de masas en tándem. En las trazas se indican el material de partida (SEQ ID NO:11) PQPQLPYPQPQLP y los fragmentos de separación A: (SEQ ID NO:11, aa. 1-8) PQPQLPYP, B: (SEQ ID NO:11, aa 7-13) YPQPQLP, C: (SEQ ID NO:12, aa 1-6) PQPQLP, D: (SEQ ID NO:11, aa 2-6) QPQLP) .

Figuras 4A-4C. Hidrólisis de (SEQ ID NO:12) LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYP QPQLPYPQPQPF por PEP de FM, PEP de MX y PEP de SC. (A) Dependencia con el tiempo de la hidrólisis en presencia de sustrato 10 μM y enzima 0, 1 μM. El sustrato aparece como un doblete a un tiempo de retención de aproximadamente 18 minutos debido a la presencia d cantidades iguales del sustrato de 32 unidades del que se elimina la Leu N-terminal; la presencia de este contaminante no afecta al análisis. A partir de las áreas de pico residuales, las velocidades de desaparición de sustrato (33 unidades + 32 unidades) se calcularon como 2, 3 μM/min (PEP de FM) , 0, 43 μM/min (PEP de MX) y 0, 07 μM/min (PEP de SC) . (B) Fragmentos de la separación inicial observados debido a la hidrólisis por PEP de FM (t = 1 min) y PEP de MX (t = 5 min) . (C) Resumen de los fragmentos de la separación inicial de la hidrólisis catalizada por PEP de FM y PEP de MX del sustrato de 33 unidades.

1. Formulación para utilizar en el tratamiento de la celiaquía que comprende una prolil endopeptidasa (PEP) y una glutamina endoproteasa, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 5

2. Formulación para utilizar según la reivindicación 1, en la que dicha PEP es PEP de flavobacterium meningosepticum, PEP de Myxococcus xanthus, PEP de Sphingomonas capsulata, o Penicillium citrinum.

3. Formulación para utilizar, según la reivindicación 1, en la que dicha prolil endopeptidasa es PEP de 10 Sphingomonas capsulata.

4. Formulación para utilizar, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha glutamina endoproteasa es cisteína proteasa B de Hordeum vulgare.

5. Formulación para utilizar, según la reivindicación 4, en la que dicha cisteína proteasa B está en una forma proenzima que se activa en condiciones ácidas.

6. Formulación para utilizar, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que dicha formulación es adecuada para la administración oral. 20

7. Formulación para utilizar, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-6, en la que dicha formulación está contenida en un recubrimiento entérico.

8. Formulación para utilizar, según la reivindicación 1, en la que dicha PEP se purifica mediante cromatografía de 25 afinidad.

9. Formulación para utilizar, según la reivindicación 1, en la que dicha PEP está liofilizada.

10. Formulación para utilizar, según la reivindicación 1, en la que dicha PEP está formulada en una forma de 30 dosificación unitaria farmacológica.

11. Formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 9 y 10 para utilizar en un método de tratamiento de intolerancia al gluten en un paciente.

12. Formulación para utilizar, según la reivindicación 11, en la que dicha formulación se mezcla con alimento.

13. Formulación para utilizar, según la reivindicación 11 ó 12, en la que dicha intolerancia al gluten está asociada con celiaquía.

14. Formulación para utilizar, según la reivindicación 1, en la que la PEP y la glutamina endoproteasa son para la administración en forma de dos dosis enzimáticas, una dosis que contiene la PEP y la otra dosis que contiene la glutamina endoproteasa.