Producción de una lípido aciltransferasa a partir de células de Bacillus licheniformis.

Un método para la producción de una lípido aciltransferasa que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula de Bacillus, en la que la célula de Bacillus es B. licheniformis;

(ii) transformar la célula de Bacillus, en la que la célula de Bacillus es B. licheniformis con una secuencia denucleótidos heteróloga que codifica una lípido aciltransferasa mostrada como SEQ ID Nº 49; y

(iii) expresar la lípido aciltransferasa en la célula bajo control de una secuencia promotora.

Producción de una lípido aciltransferasa a partir de células de Bacillus licheniformis Referencia a las solicitudes relacionadas Se hace referencia a las siguientes solicitudes relacionadas: Documentos US 2002-0009518, US 2004-0091574, WO2004/064537, WO2004/064987, WO2005/066347, WO2005/066351. Solicitud de Estados Unidos de Número de Serie 60/764.430 presentada el 2 de febrero de 2006, y documento WO2006/008508.

Campo de la presente invención La presente invención se refiere a la producción de lípido aciltransferasas. En particular, métodos para la producción de una lípido aciltransferasa mediante la expresión de una lípido aciltransferasa en una célula hospedadora de Bacillus, preferiblemente una célula hospedadora de B. licheniformis. Además, la presente invención se refiere al uso de Bacillus (preferiblemente B. licheniformis) para expresar una lípido aciltransferasa y a una célula hospedadora de Bacillus, preferiblemente una célula hospedadora de B. licheniformis, que comprende en su genoma un gen que codifica una lípido aciltransferasa.

Antecedentes de la presente invención Se sabe que las lípido aciltransferasas son ventajosas en las aplicaciones alimentarias. Se ha descubierto que las lípido aciltransferasas tienen una actividad de aciltransferasa significativa en los productos alimenticios. Esta actividad tiene aplicaciones beneficiosas sorprendentes en los métodos de preparación de productos alimenticios.

Por ejemplo, el documento WO 2004/064537 describe un método para la producción in situ de un emulsionante mediante el uso de una lípido aciltransferasa y las ventajas asociadas a ello. Por lo tanto, existe la necesidad de un método para la producción comercial de lípido aciltransferasas.

No obstante, en general los genes pueden ser difíciles de expresar en hospedadores heterólogos, y la expresión de lípido aciltransferasas en las células hospedadoras puede ser problemática.

El documento WO 2004/064537 describe la expresión de dos lípido aciltransferasas de Aeromonas en Bacillus subtilis y Escherichia Coli. No obstante, la expresión en B. subtilis es baja, mientras E. coli no es un organismo GRAS y, por lo tanto, es inadecuado como hospedador para enzimas que se van a usar en la industria alimentaria.

El documento US 6.255.076 describe un método para producir un polipéptido en una célula hospedadora de Bacillus. Sin embargo, tal método requiere el uso de un promotor en tándem en el que cada secuencia promotora esté unida de forma operable a una única copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia polipeptídica. Así, existe la necesidad en la técnica de un método mejorado para la producción de lípido aciltransferasas.

Aspectos resumen de la presente invención Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y en el siguiente comentario.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para la producción de una lípido aciltransferasa que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula hospedadora de Bacillus en la que la célula hospedadora de Bacillus es una célula de Bacillus licheniformis;

(ii) transformar la célula hospedadora de Bacillus, en la que la célula hospedadora de Bacillus es la célula de Bacillus licheniformis, con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una lípido aciltransferasa mostrada como SEQ ID Nº. 49 y

(iii) expresar la lípido aciltransferasa en la célula bajo control de una secuencia promotora.

En la presente memoria se describe una célula hospedadora de Bacillus en la que la célula hospedadora de Bacillus es distinta de Bacillus subtilis, preferiblemente una célula hospedadora de Bacillus licheniformis, que comprende una lípido aciltransferasa heteróloga.

En la presente memoria también se describe el uso de una célula hospedadora de Bacillus en la que la célula hospedadora de Bacillus es distinta de Bacillus subtilis, preferiblemente una célula hospedadora de Bacillus licheniformis, en la producción de una lípido aciltransferasa heteróloga.

De manera adecuada, la expresión en el hospedador de Bacillus, en el que el hospedador de Bacillus es distinto de Bacillus subtilis, y preferiblemente en el que el hospedador de Bacillus es B. licheniformis, puede dar como resultado una expresión incrementada en comparación con la expresión en B. subtilis.

En la presente memoria se describe un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa unida de forma operable a una o más secuencia (s) reguladora (s) de forma que la (s) secuencia (s) reguladora (s) es capaz de expresar la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa en un hospedador o célula hospedadora adecuada, preferiblemente en un hospedador (o célula) de Bacillus en el que el hospedador (o célula) de Bacillus es distinto de Bacillus subtilis, preferiblemente en B. licheniformis o una célula de B. licheniformis.

De manera adecuada, la lípido aciltransferasa puede ser una lípido aciltransferasa recombinante.

Aspectos detallados de la presente invención Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la producción de una lípido aciltransferasa que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula hospedadora de Bacillus en la que la célula hospedadora de Bacillus es una célula de Bacillus licheniformis;

(ii) transformar la célula hospedadora de Bacillus en la que la célula hospedadora de Bacillus es una célula de Bacillus licheniformis, con una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una lípido aciltransferasa mostrada como SEQ ID Nº. 49; y

(iii) expresar la lípido aciltransferasa en la célula bajo control de una secuencia promotora.

Además, se puede unir de forma operable una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal a dicha secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una lípido aciltransferasa.

De manera adecuada, el método de la presente invención puede comprender además la etapa adicional de aislar/recuperar la lípido aciltransferasa.

De manera adecuada, la lípido aciltransferasa puede ser una lípido aciltransferasa recombinante.

De manera adecuada, la secuencia promotora usada de acuerdo con las células hospedadoras, vectores, métodos y/o usos de la presente invención puede ser homóloga respecto de la célula hospedadora. "Homólogo respecto de la célula hospedadora" significa que se origina en el organismo hospedador; es decir, una secuencia promotora que se halla de manera natural en el organismo hospedador. De manera adecuada, la secuencia promotora se puede seleccionar del grupo que consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica: un promotor de a-amilasa, un promotor de proteasa, un promotor de subtilisina, un promotor de proteasa específica de ácido glutámico y un promotor de levansacarasa. De manera adecuada, la secuencia promotora puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica: el LAT (p.ej. el promotor de alfa-amilasa de B. licheniformis, también conocido como AmyL) , AprL (p.ej. promotor de subtilisina Carlsberg) , EndoGluC (p.ej. el promotor específico de ácido glutámico de B. licheniformis) , AmyQ (p.ej. el promotor de alfa amilasa de B. amyloliquefaciens) y SacB (p.ej. el promotor de levansacarasa de B. subtilis) .

En una realización de la presente descripción, la secuencia promotora es la secuencia de -35 a -10 de un promotor de alfa amilasa, preferiblemente la secuencia de -35 a -10 de un promotor de a-amilasa de B. licheniformis. La "secuencia de -35 a -10" describe la posición respecto del sitio de inicio de la transcripción. Tanto "-35" como "-10" son cajas, es decir, varios nucleótidos, cada una comprende 6 nucleótidos, y estas cajas están separadas por 17 nucleótidos. Estos 17 nucleótidos se denominan a menudo "espaciador". Esto se ilustra en la Figura 55, en la que están subrayadas las cajas de -35 y -10. Para evitar dudas, cuando se usa "secuencia de -35 a -10" en la presente memoria se refiere a una secuencia desde el inicio de la caja de -35 hasta el final de la caja de -10, es decir, que incluye la caja de -35, el espaciador de 17 nucleótidos de longitud y la caja de -10.

Una secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa para el uso en cualquiera de las células hospedadoras, vectores, métodos y/o usos descritos en la presente memoria puede comprender un motivo GDSx y/o un motivo GANDY.

Preferiblemente, la enzima lípido aciltransferasa se caracteriza como una enzima que posee actividad de aciltransferasa y que comprende el motivo de secuencia de aminoácidos GDSX, en el que X es uno... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de una lípido aciltransferasa que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula de Bacillus, en la que la célula de Bacillus es B. licheniformis;

(ii) transformar la célula de Bacillus, en la que la célula de Bacillus es B. licheniformis con una secuencia de 5 nucleótidos heteróloga que codifica una lípido aciltransferasa mostrada como SEQ ID Nº 49; y

(iii) expresar la lípido aciltransferasa en la célula bajo control de una secuencia promotora.

2. Un método según la reivindicación 1 en el que la secuencia promotora no está asociada de forma nativa con la secuencia de nucleótidos que codifica una lípido aciltransferasa.

3. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho método comprende la etapa 10 adicional de aislar/recuperar la lípido aciltransferasa.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha secuencia promotora es homóloga respecto de la célula hospedadora.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha secuencia promotora se selecciona del grupo que consiste en una secuencia promotora de a-amilasa, una secuencia promotora de proteasa,

una secuencia promotora de subtilisina, una secuencia promotora de proteasa específica de ácido glutámico y una secuencia promotora de levansacarasa.

6. Una lípido aciltransferasa obtenible mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes y codificada por SEQ ID Nº 49.

FIGURA 9 (SEQ ID N° 8)

FIGURA 31 (SEQ ID N° 38)

FIGURA 32 (SEQID N° 39)

FIGURA 35 (SEQ ID N° 42) FIGURA 36 (SEQ ID N° 43)

FIGURA 37 (SEQ ID N° 44) FIGURA 38 (SEQ ID N° 45)

FIGURA39 (SEQ ID N° 46)

FIGURA 42

FIGURA 43

SEQ ID N° 17 que es la secuencia de aminoacidos de unalipido aciltransferasa de Candidapparapsilosis;

FIGURA 44

SEQ IDN° 18 que es la secuencia de aminoacidos de una lipido aciltransferasa de Candidapparapsilosis;

FIGURA 45 FIGURA 46

FIGURA 47

FIGURA48 FIGURA 49

FIGURA 51

FIGURA 55

FIGURA 56

FIGURA 57 (SEQ ID N° 49)

FIGURA 70 (SEQ ID N° 62) FIGURA 71 (SEQ ID N° 63) FIGURA72 (SEQ ID N° 24)