Producción de proteínas recombinantes mediante escisión autoproteolítica de una proteína de fusión.

La autoproteasa NPro del virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) que tiene actividad autoproteolítica,

en la que almenos un residuo de cisteína de la autoproteasa NPro de CSFV natural seleccionada del grupo que consiste enC112, C134 y C138 está sustituido por un residuo de ácido glutámico.

Producción de proteínas recombinantes mediante escisión autoproteolítica de una proteína de fusión

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo deseado de interés con un extremo N homogéneo claramente definido en una célula huésped bacteriana, en el que inicialmente un polipéptido de fusión que comprende un derivado de la autoproteasa NPro de Pestivirus y el polipéptido heterólogo de interés se proporciona mediante la expresión en una célula huésped. El polipéptido heterólogo de interés se produce en la célula huésped en forma de cuerpos de inclusión citoplasmáticos que después se aíslan y tratan de un modo tal que el polipéptido heterólogo deseado se escinde del polipéptido de fusión mediante la actividad autoproteolítica de NPro .

Antecedentes de la invención En la producción de proteínas recombinantes en organismos heterólogos tal como la expresión de proteínas humanas u otras eucarióticas en células bacterianas a menudo es difícil obtener un extremo N definido claramente que es casi 100 % homogéneo según sea posible. Esto se aplica en particular a proteínas farmacéuticas recombinantes cuya secuencia de aminoácidos, en muchos casos, debería ser idéntica a la secuencia de aminoácidos que se produce de forma natural en seres humanos/animales.

Con la expresión natural, por ejemplo en seres humanos, muchas proteínas farmacéuticas que están en uso para terapia también se transportan al espacio extracelular. Una secuencia señal está presente en la proteína precursora para este fin y la escisión de esta secuencia señal tiene como resultado un extremo N claramente definido. Por varios motivos, dichos extremos N homogéneos no siempre son fáciles de producir, por ejemplo en células bacterianas.

Para la producción a escala industrial, muchas proteínas farmacéuticas se producen en el citoplasma de células bacterianas (p. ej., Escherichia coli) . En estas células huésped, las proteínas farmacéuticas se acumulan en cantidades adecuadas y a menudo se depositan como cuerpos de inclusión insolubles (Bis) dentro de la célula. Estos CI tienen grandes ventajas en el procesamiento y purificación de la proteína diana. Además, la proteína expresada en forma de CI está protegida de la degradación por proteasas mediante proteasas intracelulares.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cuerpos de inclusión" hará referencia a agregados que contiene polipéptidos heterólogos presentes en el citoplasma de células huésped transformadas. Estos aparecen como manchas brillantes bajo el microscopio y se pueden recuperar mediante separación del citoplasma.

No obstante, la producción de material IB requiere replegamiento in vitro de la proteína expresada. Esto puede, en muchos casos, efectuarse mediante procedimientos conocidos por sí mismos.

Solo en casos raros es adecuada la exportación de la proteína diana al periplasma bacteriano co la ayuda de una secuencia señal pro o eucariótica. Dada la baja capacidad de transporte de la maquinaria de exportación bacteriana, normalmente solo es posible acumular cantidades muy pequeñas del producto.

No obstante, el citoplasma bacteriano difiere considerablemente del espacio extracelular de los eucariotas. Una diferencia es que dentro del citoplasma bacteriano predominan las condiciones reductoras; asimismo se carece de un mecanismo para escindir las secuencias líder en N terminal para formar proteínas maduras. La síntesis de todas las proteínas citoplásmicas comienza con una metionina que se especifica mediante el codón de iniciación adecuado (ATG= inicio de la traducción) . Esta metionina en N-terminal se conserva en muchas proteínas, mientras que en otras es escindida por la metionina aminopeptidasa (MAP) presente en el citoplasma e intrínseca al huésped. La eficiencia de la escisión depende esencialmente de dos parámetros. 1. l naturaleza del aminoácido siguiente y 2. la localización del extremo N en la estructura tridimensional de la proteína. La metionina en N-terminal se elimina, preferentemente, cuando el aminoácido siguiente es serina, alanina, glicina, metionina o valina y cuando el extremo N está expuesto, es decir no "escondido" dentro de la proteína. Si el aminoácido siguiente es uno diferente, en particular uno cargado (ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina) o si el extremo N se localiza dentro de la proteína, en la mayoría de los casos, la escisión de la metionina en N-terminal no se produce.

Incluso si un aminoácido que estimula la escisión está presente en la posición 2, la escisión rara vez se completa. Es normal que una proporción no poco considerable (1 – 50 %) de la proteína diana permanezca no afectada por la MAP.

Esta falta de homogeneidad o desviación con respecto a la secuencia natural es, sin embargo, inaceptable en muchos casos porque estos productos con frecuencia muestran diferentes propiedades inmunológicas (por ejemplo, inducción de formación de anticuerpos) y farmacológicas (semivida, farmacocinética) . Por estos motivos, es necesario, en la mayoría de los casos, producir un producto idéntico natural (homogéneo y sin aminoácidos extraños en el extremo N) . En el caso de la expresión citoplásmica, aquí, en la mayoría de los casos el remedio es condensar una secuencia de escisión (líder) para una endopeptidasa específica (por ejemplo, factor Xa, enteroquinasa, endopeptidasas KEX, IgA proteasa) o aminopeptidasa (por ejemplo, dipeptidilaminopeptidasa) al extreme N de la proteína diana. No obstante, esto hace que se necesite una etapa adicional durante el procesamiento posterior, el denominado procesamiento cadena abajo de la proteína con gastos en costes y materiales. Además, en presencia de CI, en muchos casos hay interferencia, o incluso prevención completa, del replegamiento por la secuencia líder.

Los polipéptidos de fusión que comprenden la autoproteasa NPro de Pestivirus son especialmente útiles a este respecto. La autoproteasa NPro de Pestivirus siempre escinde la pareja de fusión en un sitio claramente determinado, liberando un polipéptido de interés con un extremo N homogéneo. Además, la actividad autoproteolítica de NPro puede inducirse in vitro mediante la aplicación de tampones especiales de modo que se pueda obtener el polipéptido de interés mediante escisión de los polipéptidos de fusión que se expresan en CI.

Los pestivirus son pequeños virus con cubierta con un genoma que actúa directamente como ARNm y que tiene un tamaño de 12, 3 kb y del cual se transcriben productos génicos virales en el citoplasma. Esto tiene lugar en forma de una poliproteína sencilla que comprende aproximadamente 4.000 aminoácidos y que se degrada mediante proteasas tanto virales como celulares en aproximadamente 12 proteínas maduras.

Los Pestivirus comprenden las subclases CSFV (virus clásico de la fiebre porcina) , BDV (virus de la enfermedad de la frontera) y BVDV (virus de la diarrea vírica bovina) .

NPro es una autoproteasa con una longitud de 168 aminoácidos y un Mr aparente de aproximadamente 20.000 (in vivo) . Es la primera proteína en la poliproteína de Pestivirus y sufre escisión autoproteolítica a partir de la siguiente proteína C de la nucleocápside. Esta escisión tiene lugar tras el último aminoácido en la secuencia de NPro, Cys168.

El uso de la autoproteasa NPro natural de Pestivirus para la producción de polipéptidos heterólogos de interés puede, no obstante, estar limitado, ya que la activación de la función autoproteolítica de NPro in vitro es susceptible únicamente en condiciones específicas de renaturalización. Estas condiciones que permiten la actividad de escisión de NPro in vitro son inhibidoras para ciertas otras interacciones que son necesarias o deseables en algunos contextos para la producción de polipéptidos heterólogos de interés. Como ejemplo de dichas interacciones se pueden nombrar ciertas afinidadades bioespecíficas como, por ejemplo, afinidad selectiva de péptido-proteína. También debido a otros requisitos de parámetros, ciertos procesos no permiten crear las condiciones de renaturalización favorables para NPro y, como resultado, NPro no se puede usar en estos procesos. Por tanto, la NPro natural de Pestivirus puede ser inadecuada para la producción de ciertos polipéptidos de interés y para usar en ciertas condiciones. De acuerdo con esto, existe la necesidad de una NPro de Pestivirus con mejores propiedades con el fin de potenciar la eficiencia de la escisión, para obtener mayores rendimientos del polipéptido de interés y con el fin de poder usar NPro en un abanico más amplio de condiciones, que permitan... [Seguir leyendo]

1. La autoproteasa NPro del virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) que tiene actividad autoproteolítica, en la que al menos un residuo de cisteína de la autoproteasa NPro de CSFV natural seleccionada del grupo que consiste en C112, C134 y C138 está sustituido por un residuo de ácido glutámico.

2. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 2: (1 ) -M ELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTt LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDG EI LLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- (168)

3. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que la adición de los residuos de cisteína sustituidos, al menos un residuo de aminoácido básico se sustituye con un residuo de aminoácido básico.

4. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 3, en la que además de los residuos de cisteína sustituidos se intercambian los aminoácidos siguientes: R 53 con E, G 54 con D, R 57 con E, y L 143 con Q.

5. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEQ ID Nº 3 (1) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- (168) .

6. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que la adición de los residuos de cisteína sustituidos, al menos un residuo de aminoácido hidrófobo se sustituye con un residuo hidrófilo.

7. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 6, en la que además de los residuos de cisteína sustituidos, los aminoácidos siguientes están sustituidos por T: A109, V114, 1155 y F158.

8. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 4 (1 ) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGN PSEVH PQSTLKLPHDRGRGDIETT TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEEV-TIKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWV TSC- (168)

9. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en la que además de los residuos de cisteína sustituidos se han intercambiado los aminoácidos siguientes: A109, V114, 1155 y F158 by T, R 53 con E, G 54 con 0, R 57 con E, y L 143 con Q.

10. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 5: (1) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFOETQFEETTKRIGRVTGSOGKLYHIYVEVO GEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC- (168) .

11. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 9, en la que además se han intercambiado los siguientes aminoácidos: N35 por T y T158 por S.

12. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 32: (1 ) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET TLRDLPRKGDCRSGNH LGPVSGIYI KPGPVYYQDYTGPVYH RAPLEFF DETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNSTNCPLWV TSC- (168) .

13. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 11, en la que además se han intercambiado los siguientes aminoácidos: A28 por E, S71 por F y R150 por H.

14. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 33: (1) -MELNH FELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET TLRDLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVD GEI LLKQAKRGTPHTLKWTRNSTNCPLWVTSC- (168) .

15. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos uno de los aminoácidos siguientes se han sustituido además de los residuos de cisteína sustituidos: arginina (R) 53, glicina (8) 54, arginina

(R) 57, treonina (T) 109, 114, 155, 158 y leucina (L) 143.

16. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos uno de los aminoácidos siguientes se han sustituido además de los residuos de cisteína sustituidos: arginina (R) 53 con ácido glutámico (E) , glicina (G) 54 con ácido aspártico (D) , arginina (R) 57 con ácido glutámico (E) , treonina (T) 109, 114, 155, 158 con serina (S) y leucina (L) 143 con glutamina (Q) o asparagina (N) o ácido aspártico (D) o serina (S) o histidina.

17. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 34:

(1) MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFF DESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEI LLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC- (168) .

18. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 35

(1) MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYH IYVEVDGEILLKNAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC- (168) .

19. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 36

(1) MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFF- DESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEI LLKDAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWV- TSC- (168) .

20. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 37

(1) M ELN HFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET TLRDLPRKGDCRSGN HLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYH RAPLEFF-DESQFEESTKRIGRVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKHAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWV- TSC- (168) .

21. La autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

SEC ID Nº 38

(1) MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET – TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFF- DESQFEESTKRIGCVTGSDGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWV- TSC- (168) .

22. Un procedimiento para la producción recombinante de un polipéptido heterólogo de interés, que comprende (i) cultivo de una célula huésped bacteriana que se transforma con un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, comprendiendo el polipéptido de fusión una autoproteasa Npro de CSFV de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y un segundo polipéptido que está conectado con el derivado en el extremo C del primer polipétido de un modo tal que el segundo polipéptido es capaz de ser escindido del polipéptido de fusión mediante la actividad

autoproteolítica de la autoproteasa, y siendo dicho segundo polipéptido un polipéptido heterólogo, en el que el cultivo se produce en condiciones que causan la expresión del polipéptido de fusión y la formación de los correspondientes cuerpos de inclusión citoplasmáticos.

(ii) aislamiento de los cuerpos de inclusión de la célula huésped,

(iii) solubilización de los cuerpos de inclusión aislados,

(iv) inducción de escisión autoproteolítica del polipéptido heterólogo del polipéptido de interés del polipéptido de fusión, y

(v) aislamiento del polipéptido heterólogo de interés escindido.

23. Uso de la autoproteasa NPro de CSFV de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 21 en un procedimiento de 15 acuerdo con la reivindicación 22.