Producción de productos recombinantes usando membranas capilares.

Un método para producir al menos un producto recombinante en condiciones aireadas,

incluyendo dichométodo:

proporcionar un sustrato poroso que tiene un primer lado y un segundo lado y que tiene una biopelícula demicroorganismos unida al primero de sus lados, estando el sustrato configurado para permitir el paso a su través deuna solución de nutrientes e impedir el paso a su través de células de microorganismos; y

hacer fluir una solución de nutrientes a través del sustrato y la biopelícula en una dirección desde el segundode sus lados hasta el primero de sus lados en condiciones aireadas, en donde el caudal de la solución de nutrientesdesde el segundo lado hasta el primer lado es 0,001 - 10 volúmenes de solución de nutrientes por volumen de bioreactor y por hora, proporcionando con ello un gradiente de nutrientes que tiene una diferencia de concentración através de la biopelícula, en el que la concentración de nutrientes es mayor más cerca del sustrato para manteniendocon ello el crecimiento primario de los microorganismos y en el que la concentración de nutrientes es menor máslejos del sustrato con lo cual se provoca que los microorganismos entren en una fase estacionaria y la mantengan,siendo los microorganismos inducidos a producir el producto recombinante.

Producción de productos recombinantes usando membranas capilares Campo de la invención Esta invención se refiere a la producción de productos recombinantes. En particular, se refiere a un método para producir productos recombinantes en condiciones aerobias y a un aparato para producir dichos productos recombinantes en condiciones aerobias.

Técnica anterior

Se ha descrito previamente la aplicación de cartuchos de membranas de fibras huecas para cultivos microbianos. El objetivo principal del uso de cartuchos de membranas para el cultivo de células es permitir el cultivo celular continuo de alta densidad para mejora de la productividad. Sin embargo, lo que en última instancia distingue unos de otros a los diferentes procesos de cultivo celular es la configuración, el funcionamiento y la aplicación de estos cartuchos de membranas. Por ejemplo, Canovas et al., (2005) utilizan un recipiente de reactor estándar conectado a un cartucho de filtración por membranas de flujo transversal para el reciclaje y la concentración de E. coli dentro del recipiente del reactor. En contraste, Inloes et al., (1983) buscaron utilizar el cartucho de membranas en sí mismo como el recipiente de cultivo celular por el atrapamiento de E. coli en crecimiento activo dentro de la matriz de la membrana macroporosa, reponiendo los nutrientes por difusión desde el lumen de las membranas; mientras que Leukes et al., (EP 0761608, publicada el 12 de marzo de 1997) inmovilizaron el hongo filamentoso P. chr y sosporium como una biopelícula sobre la superficie exterior de las membranas, suministrando los nutrientes suministrados a las células inmovilizadas desde el lumen por el flujo de convección a través de la pared de las membranas hasta la biopelícula de células

Antecedentes de la invención Los productos recombinantes incluyendo, aunque sin limitación, enzimas, hormonas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, partículas similares a virus, péptidos, fragmentos de DNA y RNA son producidos por una variedad de sistemas de expresión microbianos. Los productos también pueden incluir productos químicos resultantes de la expresión de enzimas sintéticas recombinantes.

El mercado de productos recombinantes para la industria farmacéutica, así como otras industrias ha aumentado en los últimos años. Los productos comerciales incluyen tanto productos recombinantes expresados en hospedantes recombinantes como productos químicos producidos por enzimas biosintéticas recombinantes.

La producción eficaz de tales productos recombinantes se basa típicamente en el uso de hospedantes de expresión eficaces, así como una buena tecnología de bioprocesos. Los hospedantes de expresión incluyen cierto número de especies de bacterias de las cuales Escherichia coli es la más prominente, así como hongos, protozoos, plantas, insectos y células de mamíferos. Algunos de los productos son intracelulares, pero se prefiere que los productos sean excretados en el medio para facilitar la purificación. La mayoría de los sistemas de expresión son aerobios, requiriendo una considerable aportación de energía para aumentar la transferencia de masa de oxígeno en bioreactores de cultivos sumergidos. La mayoría de la tecnología de bioprocesos se centra en la producción de concentraciones muy altas de células en el bio-reactor, por lo general por el modo de cultivo de alimentación discontinua. Los hospedantes de producción están modificados por ingeniería genética para producir productos recombinantes de interés constitutivo o una vez está presente suficiente biomasa los hospedantes de producción son inducidos a expresar los productos recombinantes de interés. Esta inducción es típicamente una molécula que se añade en el momento apropiado o es un metabolito producido por el hospedante de producción como un producto de desecho metabólico o un metabolito secundario.

La estrategia para inducir la producción de proteínas recombinantes una vez que el cultivo está en fase estacionaria es típica puesto que:

1) Permite la producción de productos que son tóxicos para el organismo que los produce.

2) Se mejora la productividad volumétrica si la concentración de biomasa en el reactor es muy alta.

3) Los precursores para la formación del producto son típicamente metabolitos primarios, que se acumulan durante la fase de crecimiento primario. En cultivos discontinuos sumergidos frecuentemente es difícil programar óptimamente en el tiempo la adición de inductores de proteínas recombinantes, de modo que los inductores se añadan cuando el cultivo alcance la fase estacionaria y no demasiado pronto o demasiado tarde. Es particularmente difícil cuando se realizan múltiples cultivos en paralelo en diferentes condiciones durante los experimentos de optimización.

Aunque la mayoría de los hospedantes de expresión de proteínas recombinantes son organismos aerobios, el cultivo de alta densidad está limitado debido a las limitaciones de transferencia de la masa de oxígeno y a la toxicidad o las limitaciones de solubilidad de los nutrientes suministrados al medio de crecimiento. Los factores que afectan a la productividad volumétrica de los bio-reactores para producir proteínas recombinantes incluyen: entorno de baja cizalladura, alta concentración de biomasa, amplia fase de producción y buena transferencia de masa de nutrientes.

Por lo general, en los cultivos de alta densidad la transferencia de masas de oxígenos y de nutrientes está influenciada por la morfología y/o la reología del cultivo. En cultivos sumergidos, la expresión de los productos recombinantes en organismos filamentosos, tales como Aspergillus están especialmente afectados por la diferenciación morfológica y la formación de pelets y la productividad se ha mejorado por la inmovilización del organismo recombinante. La inmovilización no sólo limita la tensión de cizalladura y reduce la viscosidad del caldo, mejorando el suministro de oxígeno y la transferencia de masa de nutrientes, sino que también ha demostrado inhibir la producción de proteasa extracelular en Aspergillus niger, limitando de ese modo la degradación de las proteínas recombinantes producidas por este organismo (Wang et al., 2005) . En la mayoría de sistemas inmovilizados las limitaciones de transferencia de masa de oxígeno mantienen una etapa limitante de la velocidad en la productividad.

Inloes et al., (1983) trataron de mejorar la producción de proteínas recombinantes por el atrapamiento de E. coli en crecimiento activo dentro de la matriz macroporosa de la pared de las membranas de fibras huecas. Esta solución dio como resultado un entorno de baja cizalladura con alta concentración de biomasa; sin embargo, la transferencia de masa de nutrientes estaba limitada a la difusión desde el lumen de las membranas hasta las células atrapadas, mientras que el atrapamiento de las células en crecimiento activo resultó problemático, puesto que se rompió la pared de las membranas y llegó a contaminarse la alimentación de nutrientes.

La presente invención supera los problemas encontrados por Inloes et al., (1983) inmovilizando el microorganismo sobre la superficie de la membrana en forma de una biopelícula de células y controlando la velocidad de suministro de nutrientes a los microorganismos, de tal manera que una porción de células inmovilizadas se mantenga como células en crecimiento activo, mientras que una porción adicional entre en la fase estacionaria de crecimiento y se mantiene en ella, como describen Leukes et al., (EP 0761608, publicada el 12 de marzo de 1997) de tal manera que las células en fase estacionaria puedan ser inducidas a producir productos recombinantes que puedan ser cosechados de forma continua desde estas células en fase estacionaria.

Cualquier referencia en la presente memoria a un "microorganismo" debe interpretarse que significa una referencia a organismos que son miembros del grupo de bacterias, hongos, protozoos e incluye células de mamíferos o plantas que han sido modificadas por ingeniería genética para producir productos recombinantes en condiciones aerobias.

Cualquier referencia en la presente memoria a una "fase estacionaria" debe interpretarse que significa un período de crecimiento limitado o el crecimiento y la muerte sustancialmente en equilibrio que normalmente sigue inmediatamente después de la fase de crecimiento primario en cultivos en discontinuo o en continuo de microorganismos.

Cualquier referencia en la presente memoria a "proteína recombinante" se debe interpretar como sinónimo de "producto recombinante" y significa cualquier producto o el producto de dicha proteína si se trata de un producto biosíntético, homólogo o heterólogo para el hospedante de expresión, cuya producción... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir al menos un producto recombinante en condiciones aireadas, incluyendo dicho método:

proporcionar un sustrato poroso que tiene un primer lado y un segundo lado y que tiene una biopelícula de microorganismos unida al primero de sus lados, estando el sustrato configurado para permitir el paso a su través de una solución de nutrientes e impedir el paso a su través de células de microorganismos; y

hacer fluir una solución de nutrientes a través del sustrato y la biopelícula en una dirección desde el segundo de sus lados hasta el primero de sus lados en condiciones aireadas, en donde el caudal de la solución de nutrientes desde el segundo lado hasta el primer lado es 0, 001 - 10 volúmenes de solución de nutrientes por volumen de bioreactor y por hora, proporcionando con ello un gradiente de nutrientes que tiene una diferencia de concentración a través de la biopelícula, en el que la concentración de nutrientes es mayor más cerca del sustrato para manteniendo con ello el crecimiento primario de los microorganismos y en el que la concentración de nutrientes es menor más lejos del sustrato con lo cual se provoca que los microorganismos entren en una fase estacionaria y la mantengan, siendo los microorganismos inducidos a producir el producto recombinante.

2. Un método de la reivindicación 1, en donde los microorganismos se seleccionan del grupo que consiste en: Aspergillus sp., Trichoderma sp., Mucor sp., Pichia sp., Fusarium sp., Neurospora sp., Penicillium sp., Streptomyces sp., Chr y sosporium lucknowense y Mortierella alpinis.

3. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el método se lleva a cabo durante un periodo d.

2. 60 días.

4. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la biopelícula tiene un espesor de 0, 1 10 mm.

5. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que incluye añadir una molécula inductora a la solución de nutrientes, de tal modo que el caudal de la solución de nutrientes desde el segundo lado a través del sustrato y la biopelícula hasta el primer lado lleva dicho inductor hasta los microorganismos con lo cual induce la producción de al menos un producto recombinante por los microorganismos y en donde el inductor es opcionalmente un metabolito primario o secundario que se acumula dentro de la biopelícula, de tal modo que cuando el inductor es llevado a través de la biopelícula en la solución de nutrientes da como resultado un gradiente de concentración, en el que la concentración del inductor es menor más cerca del sustrato y mayor más lejos del sustrato induciendo con ello la expresión de al menos un producto recombinante por el microorganismo.

6. Un método de la reivindicación 7, en donde el inductor se selecciona de al menos uno de isopropil--Dtiogalacósido (IPTG) (0, 1 - 1 mM) , metanol (0, 5 - 1, 5%) y ácidos orgánicos producidos por el microorganismo.

7. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el producto recombinante es producido intracelularmente por los microorganismos.

8. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el producto recombinante es producido extracelularmente por los microorganismos.

9. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que incluye poner en contacto la biopelícula con un gas.