Procedimiento y dispositivos para la determinación electroquímica de inhibidores de factor Xa en muestras de sangre.

Procedimiento para la determinación de inhibidores de factor Xa en muestras de sangre,

caracterizadoporque

a) una muestra de la sangre a analizar es puesta en contacto con un reactivo de detección, que contiene,

como mínimo, un sustrato de trombina, que está constituido por un residuo peptídico, que puede ser disociado por latrombina y que está unido amídicamente con intermedio del extremo carboxilo a una sustancia electrogénica y conun reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X y un reactivo activador, que provoca la transformaciónde factor X en factor Xa, de manera que la adición del reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X a lamuestra tiene lugar en una etapa común con la adición del reactivo activador a la muestra,

b) la cantidad o la actividad de la sustancia electrogénica que es disociada del sustrato de trombina por laactivación de la trombina inducida por el factor Xa y/o su comportamiento en el tiempo se determinan como señal demedición por procedimientos electroquímicos, y

c) con ayuda de esta señal de medición, se determina la cantidad de inhibidor de factor Xa en la muestra desangre a analizar o una magnitud de medición correlacionada con aquélla, en particular un tiempo de coagulaciónque se correlaciona con éste.

Procedimiento y dispositivos para la determinación electroquímica de inhibidores de factor Xa en muestras de sangre 5 Sector de la invención:

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación electroquímica de inhibidores de factor Xa, en especial, de heparinas y derivados de heparina, así como inhibidores directos de factor Xa en muestras de sangre.

Además, la invención se refiere a elementos de prueba basados en química seca y a sistemas de análisis elementos de prueba para la determinación electroquímica de inhibidores de factor Xa, en especial, de heparinas y derivados de heparina, así como inhibidores directos de factor Xa en muestras de sangre.

Estado de la técnica:

Para la profilaxis y terapia de alteraciones hemostáticas (alteraciones del sistema de coagulación) , se utilizan frecuentemente en la práctica clínica, anticoagulantes, entre los que se cuentan también, en especial, las heparinas. La heparina y los derivados de la heparina se utilizan en especial para la terapia y profilaxis de enfermedades tromboembólicas. Son muy eficaces en la profilaxis y tratamiento de trombosis de vena de las piernas, embolias pulmonares y para el tratamiento de angina de pecho inestable, así como infarto de miocardio agudo. Se utilizan también en múltiples casos, durante operaciones, en especial en actuaciones cardiológicas (Bypass) y en transfusiones sanguíneas.

El efecto de las heparinas se basa en especial en su interacción con antitrombina III (ATIII) , mediante la cual producen una variación de la conformación de la ATIII. De esta manera, se acelera la inactivación de determinadas enzimas de la coagulación (trombina (FIIa) , factor Xa (FXa) y factor IXa) , y de esta manera retrasa la coagulación. Las heparinas pueden ser, por lo tanto clasificadas en la clase de inhibidores de factor Xa. Otros inhibidores de factor Xa son, por ejemplo, determinados oligosacáridos tales como el pentasacárido Fondaparinux, o bien inhibidores directos de factor Xa de bajo peso molecular que se encuentran todavía en desarrollo clínico, que se pueden asociar a diferentes tipos de sustancias. Además de las heparinas no fraccionadas utilizadas desde hace mucho tiempo (UFH = heparina no fraccionada) , desde el final de los años 1980 se utilizan también diferentes heparinas fraccionadas o heparinas de bajo peso molecular (=LMWH) . Las heparinas fraccionadas sustituyen en el momento actual, para muchas indicaciones, la UFH, y se fabrican mediante despolimerización química o enzimática,

partiendo de heparinas no fraccionadas, de manera que se generan fragmentos que tienen solamente, de manera aproximada, 1/3 de la magnitud de la heparina estándar. Para ello, se debilita, entre otras medidas, el efecto de estas LMWH sobre la trombina, mientras que se favorece la inactivación de factor Xa. Las heparinas fraccionadas presentan, a causa de su farmacocinética ventajosa, otras ventajas con respecto a las heparinas no fraccionadas convencionales. Un resumen de estos tipos de sustancias con respecto a su efecto clínico y significación, se puede encontrar en la obra "Heparin and Low-Molecular-Weight Heparin (Mechanisms of Action, Pharmakokinetics, Dosing, Monitoring, Efficacy, and Safety) ", Hirsh et al.; Chest 2001; 119: 64S-94S.

Para pacientes a los que se administrará heparina no fraccionada, se prescribe un control a causa de la variabilidad individual de la biodisponibilidad de la unión de proteína y un tiempo de vida media reducido de 30-150 minutos, 45 para evitar una eventual sobredosificación con una mayor tendencia al sangrado, o bien una subdosificación con un mayor riesgo de trombosis. El control de la terapia con UFH tiene lugar en la rutina clínica de manera más frecuente en el tiempo de activación parcial de tromboplastina (aPTT) , pero también mediante el tiempo de coagulación de la trombina (TCT) o el tiempo de coagulación activada (ACT) . Estos análisis son los llamados análisis globales, puesto que reflejan de manera no específica la constitución de un coágulo de fibrina inducido por trombina. La prueba 50 aPTT, que entre otros determina la actividad de los factores del sistema intrínseco, es especialmente sensible a los efectos inhibidores de la heparina sobre trombina. La prueba aPTT es sensible para el rango de heparina de 0, 1-0, 7 U/ml de manera que, no obstante, tanto el rango normal de la aPTT como también su rango terapéutico, dependen muy fuertemente del reactivo y del dispositivo de análisis utilizado. Otro factor limitativo es la estabilidad de la muestra, que frecuentemente conduce a resultados falseados después de un largo periodo de tiempo de espera de 55 la muestra sanguínea. Otros inconvenientes de estos análisis globales de la coagulación son, entre otros, la realización frecuentemente compleja de la prueba, que requiere personal especialmente entrenado para conseguir resultados reproducibles y, asimismo, la relativamente elevada utilización de reactivos de esta prueba.

A causa de la mejor farmacocinética, el control de la administración de heparinas de bajo peso molecular en 60 pacientes normales, no es crítico. La comprobación de la terapia se recomienda, no obstante, al inicio del tratamiento, y es necesaria en especial en pacientes con insuficiencia renal a causa de su eliminación renal alterada, recomendándose también en pacientes con peso corporal extremo, recién nacidos, niños, embarazadas, o para utilización durante varias semanas o bien después de trauma o de operaciones recientes.

En la rutina clínica, se utiliza para el control de LMWH sobre todo la utilización de aPTT, aunque esta prueba es poco sensible para este anticoagulante y además depende de manera muy marcada del reactivo de determinación utilizado.

Una prueba apropiada para el control del efecto de heparinas de bajo peso molecular es una prueba de FXa.

Las pruebas de FXa llevadas a cabo hasta el momento se han realizado principalmente como Pruebas Cromogénicas o Pruebas de Coagulación, midiendo la actividad de factor Xa en la prueba Cromogénica y la coagulación en la Prueba de Coagulación. Ambos principios de prueba siguen el mismo desarrollo de la prueba:

1. FXa + [Heparina/Antitrombina III] - [FXa/Heparina/ATIII]-Complejo + FXa restante

2. a) FXa restante disociado de sustrato específico de FXa de un residuo cromógeno (Prueba de Cromógeno) .

b) FXa restante disocia protrombina en trombina (Prueba de Coagulación de reticulación de fibrina inducida por trombina) .

En la administración de la muestra se une en una cantidad definida en el reactivo de prueba, el factor Xa existente con la heparina contenida en la muestra y antitrombina III y constituye con estos un complejo inactivado. El factor Xa restante disocia o bien el sustrato cromógeno o bien forma trombina con los factores de coagulación contenidos en la muestra, que disocia el fibrinógeno en fibrina (constitución de coágulo) . Según la actividad de factor Xa, se disocia una cantidad mayor o menor del sustrato. La actividad de factor Xa es nuevamente dependiente de la cantidad de heparina contenida en la muestra. Si bien las pruebas de cromógeno son específicas para la actividad de FXa de la muestra, las pruebas de coagulación no miden exclusivamente la actividad de FXa, siendo, no obstante, frecuentemente más sensibles para LMWH que la aPTT.

Comercialmente, se tienen a disposición más pruebas de cromógeno, pero solamente pocas pruebas de coagulación (Heptest de la firma Sigma, ENOX-Test de la firma Pharmanetics) . Las diferentes pruebas se correlacionan entre sí y con respecto a aPTT solamente de forma moderada, puesto que tienen diferentes puntos finales. Las pruebas de cromógeno facilitan actividades, no tiempos de coagulación. La correlación entre tiempo de coagulación y actividad de factor Xa es, no obstante, solamente moderada. Además, estas pruebas de cromógeno requieren una separación del plasma y, por lo tanto, no pueden ser utilizadas directamente en muestras de sangre completa. Estos procedimientos de determinación requieren, por las dificultosas etapas de preparación de la muestra y etapas de realización, así como los dispositivos necesarios, una elevada inversión de tiempo, de personal

y de aparatos. La Heptest facilita como resultado ciertamente un tiempo de coagulación, pero este puede resultar muy diferente a causa de la diferente sensibilidad a la heparina de los pacientes para igual concentración de heparina. Además, se hace necesaria la determinación de una curva de calibración de la que se puedan leer los resultados de la prueba. Como prueba de química seca, y por lo tanto también para aparatos de punto de cuidados apropiados, solamente existe una prueba disponible para factor... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinación de inhibidores de factor Xa en muestras de sangre, caracterizado porque a) una muestra de la sangre a analizar es puesta en contacto con un reactivo de detección, que contiene, como mínimo, un sustrato de trombina, que está constituido por un residuo peptídico, que puede ser disociado por la trombina y que está unido amídicamente con intermedio del extremo carboxilo a una sustancia electrogénica y con un reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X y un reactivo activador, que provoca la transformación de factor X en factor Xa, de manera que la adición del reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X a la muestra tiene lugar en una etapa común con la adición del reactivo activador a la muestra,

b) la cantidad o la actividad de la sustancia electrogénica que es disociada del sustrato de trombina por la activación de la trombina inducida por el factor Xa y/o su comportamiento en el tiempo se determinan como señal de 15 medición por procedimientos electroquímicos, y

c) con ayuda de esta señal de medición, se determina la cantidad de inhibidor de factor Xa en la muestra de sangre a analizar o una magnitud de medición correlacionada con aquélla, en particular un tiempo de coagulación que se correlaciona con éste.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza como reactivo activador un activador o un complejo asociado de la vía extrínseca de la coagulación plasmática, en particular, el factor tisular y/o el factor VIIa, o un activador o un complejo asociado de la vía intrínseca de la coagulación plasmática, en particular, el factor XIIa, o una sustancia que provoca una transformación de factor X en factor Xa.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X y el reactivo activador se encuentran conjuntamente en estado seco y la transformación de factor X en factor Xa solo se produce por el contacto con la muestra.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado porque el reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X, el reactivo activador y el reactivo de detección se encuentran conjuntamente en estado seco y la transformación de factor X en factor Xa solo se produce por el contacto con la muestra.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el inhibidor de factor Xa es una heparina, en particular, una heparina fraccionada o una heparina de bajo peso molecular, un inhibidor indirecto selectivo o un inhibidor directo de factor Xa.

6. Elemento de prueba que presenta un sensor electroquímico a base de química seca para la detección de inhibidores de factor Xa, en particular, de heparinas no fraccionadas y de heparinas fraccionadas o de bajo peso 40 molecular, de inhibidores indirectos selectivos de factor Xa y de inhibidores directos de factor Xa que presenta, sobre un soporte inerte, como mínimo dos electrodos y que contiene, como reactivos de química seca, un reactivo de detección que contiene, como mínimo, un sustrato de trombina constituido por un residuo peptídico que puede ser disociado por la trombina y que está unido amídicamente mediante el extremo carboxilo a una sustancia electrogénica así como, como mínimo, un reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X y un reactivo 45 activador, que provoca la transformación de factor X y el factor Xa, encontrándose el reactivo activador sobre el elemento de prueba conjuntamente con el reactivo que contiene una cantidad conocida de factor X, eventualmente también conjuntamente con el reactivo de detección, de manera que la transformación de factor X en factor Xa solo se produce por el contacto con la muestra.

7. Sistema de análisis electroquímico con elemento de prueba, que contiene, como mínimo, un aparato de medición de la corriente eléctrica o de la tensión y un elemento de prueba, según la reivindicación 6.