Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones.

Un polipéptido ActRIIB soluble que comprende un dominio extracelular de un polipéptido ActRIIB quetiene una secuencia aminoacídica al menos al 97% idéntica a la SEQ ID NO:

2, un enlazador flexible que tiene lasecuencia TGGG, y un dominio Fc de inmunoglobulina, en el que el dominio Fc de inmunoglobulina estácondensado al extremo C del dominio extracelular del polipéptido ActRIIB mediante el enlazador flexible, y en el queel polipéptido ActRIIB comprende un dominio de unión a GDF8 alterado que incluye una o más mutaciones queaumentan la selectividad del dominio de unión para

(a) GDF8 sobre activina con respecto al dominio de unión a GDF8 de SEQ ID NO: 2,

(b) activina sobre GDF8 con respecto al dominio de unión a GDF8 de SEQ ID NO: 2, o

(c) GDF8 y activina con respecto al dominio de unión a GDF8 de SEQ ID NO: 2.

Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº de Serie 60/590.765, presentada el 23 de julio de 2004.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) contiene una diversidad de factores de crecimiento que comparten elementos de secuencia y motivos estructurales comunes. Se sabe que estas proteínas ejercen efectos biológicos en una gran diversidad de tipos celulares tanto en vertebrados como en invertebrados. Los miembros de la superfamilia realizan importantes funciones durante el desarrollo embrionario en la formación de patrones y especificación de tejido, y pueden influenciar una diversidad de procesos de diferenciación, incluyendo adipogénesis, miogénesis, condrogénesis, cardiogénesis, hematopoyesis, neurogénesis, y diferenciación celular epitelial. La familia se divide en dos ramas generales: las ramificaciones BMP/GDF y TGF-beta/Activina/BMP10, cuyos miembros tienen efectos diversos, aunque complementarios. Mediante la manipulación de la actividad de un miembro de la familia TGF-beta, con frecuencia es posible originar cambios fisiológicos importantes en un organismo. Por ejemplo, las crías de ganado Piedmontese y Belgian Blue llevan una mutación de pérdida de función en el gen GDF8 (también denominada miostatina) que origina un marcado aumento en la masa muscular. Grobet y col., Nat Genet. 1997, 17 (1) : 71-4. Además, en los seres humanos, los alelos inactivos de GDF8 están asociados con un aumento de la masa muscular, y al parecer, una fuerza excepcional. Schuelke y col., N Engl J Med 2004, 350: 2682-8.

Los cambios en músculo, hueso, cartílago y otros tejidos pueden lograrse mediante una señalización de agonización o antagonización que está mediada por un miembro de la familia TGF-beta adecuado. Por lo tanto, existe la necesidad de agentes que funcionen como reguladores potentes de señalización de TGF-beta.

El documento WO 2004/039948 A (WYETH) 13 de mayo de 2004 se refiere a procedimientos y composiciones para inhibir la actividad del factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF-8) in vitro e in vivo, que puede usarse para diagnosticar, prevenir o tratar trastornos degenerativos de homeostasis muscular, ósea o de la glucosa.

Gray PC y col., J Biol Chem. 2000, 275 (5) : 3206-3212 se refieren a la identificación de un sitio de unión en el receptor de activina de tipo II para activina e inhibina, y describen un grupo de tres residuos hidrófobos (Phe (42) , Trp (60) y Phe (83) ) que, cuando mutan individualmente a alanina en el contexto del receptor de longitud completa, provocan la interrupción de la unión de activina e inhibina a ActRII.

Thompson TB y col., EMBO J. 2003, 22 (7) : 1555-1566 se refieren a estructuras de un complejo de ActRIIB:activina A que revela un modo de unión novedoso para las interacciones del ligando TGF-beta:receptor. El ActRIIB se une a los bordes externos de las regiones de dedo de activina, con los dos receptores yuxtapuestos en estrecha proximidad, en un modo que difiere de la unión de TGF-beta3 a receptores de tipo II.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención es como se describe en las reivindicaciones adjuntas.

En ciertos aspectos, la presente divulgación proporciona polipéptidos ActRII. Dichos polipéptidos ActRII pueden usarse para el tratamiento de una diversidad de trastornos o afecciones, en particular, trastornos musculares y neuromusculares (por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y atrofia muscular) , crecimiento no deseado de hueso/cartílago, trastornos del tejido adiposo (por ejemplo, obesidad) , trastornos metabólicos (por ejemplo, diabetes tipo 2) , trastornos neurodegenerativos. En realizaciones específicas, los polipéptidos ActRII de la invención (por ejemplo, polipéptidos ActRII solubles) pueden antagonizar generalmente un receptor ActRII (por ejemplo ActRIIA o ActRIIB) en cualquier proceso asociado con la actividad de ActRII. Opcionalmente, los polipéptidos ActRII de la invención pueden estar diseñados para antagonizar preferiblemente uno o más ligandos de los receptores ActRII, tal como GDF8 (también denominado miostatina) , GDF11, activina, Nodal y BMP7 (también denominado OP-1) , o, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos adicionales. Los ejemplos de polipéptidos ActRII incluyen los polipéptidos ActRII de origen natural, así como variantes funcionales de los mismos.

En ciertos aspectos, la divulgación proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido ActRII soluble (por ejemplo ActRIIA o ActRIIB) que se une a un ligando ActRII, tal como GDF8, GDF11, activina, BMP7 o nodal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, el polipéptido ActRII soluble se une a un ligando ActRII con un Kd menor de 10 micromolar o menor de 1 micromolar, 100, 10 ó 1 nanomolar. Opcionalmente, el polipéptido ActRII soluble inhibe la señalización ActRII, tal como los eventos de transducción de señal intracelular desencadenados por un ligando ActRII. Un polipéptido ActRII soluble para su uso en una preparación de este tipo puede ser cualquiera de los desvelados en este documento, tales como un polipéptido que tiene una secuencia aminoacídica seleccionada entre las SEQ ID NOs: 1-2 y 9-12, o que tiene una secuencia aminoacídica que es al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idéntica a una secuencia aminoacídica seleccionada entre las SEQ ID NOs: 1-2 y 9-12. Un polipéptido ActRIIBA soluble puede incluir un fragmento funcional de un polipéptido ActRII natural, tal como uno que comprende 10, 20 ó 30 aminoácidos de una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOs: 1-4 y 9-12, o una secuencia de la SEQ ID NO: 1 ó 2, que carece de 10 a 15 aminoácidos C-terminal (la "cola") . Un polipéptido ActRII soluble puede incluir una o más alteraciones en la secuencia aminoacídica (por ejemplo en el dominio de unión a ligando) con respecto a un polipéptido ActRII de origen natural. La alteración en la secuencia aminoacídica, por ejemplo, puede alterar la glucosilación del polipéptido cuando se produce en un mamífero, insecto u otra célula eucariótica, o alterar la escisión proteolítica del polipéptido con respecto al polipéptido ActRII de origen natural. Un polipéptido ActRII soluble puede ser una proteína de fusión que tiene, como un dominio, un polipéptido ActRII (por ejemplo, un dominio de unión a ligando de un ActRII) y uno o más dominios adicionales que proporcionan una propiedad deseada, tal como farmacocinéticas mejoradas, purificación más fácil, dirección a tejidos particulares, etc. Por ejemplo, un dominio de una proteína de fusión puede mejorar uno o más de la estabilidad in vivo, semivida in vivo, captación/administración, localización o distribución en tejido, formación de complejos de proteína, multimerización de proteína de fusión y/o purificación. Una proteína de fusión ActRII soluble puede incluir un dominio de inmunoglobulina Fc (de tipo natural o mutante) o una albúmina sérica. En un caso preferido, una fusión ActRU-Fc comprende un enlazador relativamente no estructurado entre el dominio Fc y el dominio ActRII extracelular. Este enlazador no estructurado puede corresponder rigurosamente a una región no estructurada de 15 aminoácidos en el extremo C-terminal del dominio extracelular de ActRIIA o ActRIIB (la "cola") , o puede ser una secuencia artificial de entre 5 y 15, 20, 30, 50 o más aminoácidos que están relativamente libres de una estructura secundaria. Un enlazador puede tener alto contenido de residuos de glicina y prolina y, por ejemplo, puede contener secuencias de repetición de treonina/serina y glicinas (por ejemplo repeticiones TG4 o SG4) . Una proteína de fusión puede incluir una subsecuencia de purificación, tal como una etiqueta de epítopo, una etiqueta de FLAG, una secuencia de polihistidina, y una fusión GST. Opcionalmente, un polipéptido ActRII soluble incluye uno o más residuos aminoacídicos modificados seleccionados entre: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a una porción lipídica, y un aminoácido conjugado a un agente de derivación orgánico. Una preparación farmacéutica también puede incluir uno o más compuestos adicionales, tales como un compuesto que se usa para tratar un trastorno asociado con ActRII. Preferiblemente, una preparación farmacéutica está substancialmente libre de pirógenos. En general, se prefiere que una proteína ActRII se exprese en una línea celular de mamífero que medie una glucosilación... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido ActRIIB soluble que comprende un dominio extracelular de un polipéptido ActRIIB que tiene una secuencia aminoacídica al menos al 97% idéntica a la SEQ ID NO: 2, un enlazador flexible que tiene la secuencia TGGG, y un dominio Fc de inmunoglobulina, en el que el dominio Fc de inmunoglobulina está condensado al extremo C del dominio extracelular del polipéptido ActRIIB mediante el enlazador flexible, y en el que el polipéptido ActRIIB comprende un dominio de unión a GDF8 alterado que incluye una o más mutaciones que aumentan la selectividad del dominio de unión para

(a) GDF8 sobre activina con respecto al dominio de unión a GDF8 de SEQ ID NO: 2,

(b) activina sobre GDF8 con respecto al dominio de unión a GDF8 de SEQ ID NO: 2, o

(c) GDF8 y activina con respecto al dominio de unión a GDF8 de SEQ ID NO: 2.

2. El polipéptido ActRIIB soluble de la reivindicación 1, en el que la secuencia aminoacídica del dominio extracelular del polipéptido ActRIIB es al menos al 98% idéntico a SEQ ID NO: 2.

3. El polipéptido ActRIIB soluble de la reivindicación 1, en el que la secuencia aminoacídica del dominio extracelular del polipéptido ActRIIB es al menos al 99% idéntico a SEQ ID NO: 2.

4. El polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio Fc de inmunoglobulina comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 13.

5. El polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior, en el que el residuo aminoacídico Asp en la posición 62 de la SEQ ID NO: 2 muta a un residuo aminoacídico seleccionado entre el grupo que consiste en: un aminoácido no cargado, un aminoácido negativo y un aminoácido hidrófobo.

6. El polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido ActRIIB soluble incluye uno o más residuos aminoacídicos modificados seleccionados entre: un aminoácido glucosilado, un aminoácido PEGilado, un aminoácido farnesilado, un aminoácido acetilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido conjugado a una porción lipídica, y un aminoácido conjugado a un agente de derivación orgánico.

7. El polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido ActRIIB soluble tiene una o más de las siguientes características:

se une a un ligando ActRIIB con un Kd de al menos 10-5 M; e inhibe la señalización de ActRIIB en una célula.

8. El polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido ActRIIB soluble se une a un ligando ActRIIB con un Kd de menos de 1 micromolar.

9. El polipéptido ActRIIB soluble de la reivindicación 7 u 8, en el que el ligando ActRIIB se selecciona entre el grupo que consiste en: BMP7, GDF8, GDF11 y Nodal.

10. El polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio de unión a GDF8 alterado incluye una mutación A64R, usando la numeración de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

11. El polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior, en el que el dominio de unión a GDF8 alterado incluye una mutación K74A, usando la numeración de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

12. Una preparación farmacéutica para el tratamiento de un trastorno asociado a ActRIIB, que comprende: el polipéptido ActRIIB soluble de cualquier reivindicación anterior; y un transportador farmacéuticamente aceptable.

13. La preparación farmacéutica de la reivindicación 12, en la que dicha preparación es sustancialmente libre de pirógenos.

14. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia codificante para un polipéptido ActRIIB soluble de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

15. Un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia promotora unida de forma operativa a un polinucleótido de la reivindicación 14.

16. Una célula transformada con un polinucleótido recombinante de la reivindicación 15.

17. La célula de la reivindicación 16, en la que la célula es una célula de mamífero.

18. La célula de la reivindicación 17, en la que la célula es una célula humana.

19. Un procedimiento de elaboración de un polipéptido ActRIIB soluble, que comprende:

a) cultivar una célula en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido ActRIIB soluble, en el que dicha célula se transforma con un polinucleótido recombinante de la reivindicación 15; y

b) recuperar el polipéptido ActRII soluble expresado de este modo.

20. Un polipéptido ActRIIB de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de una distrofia muscular.

21. El polipéptido ActRIIB para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la distrofia muscular se selecciona entre el grupo que consiste en: Distrofia Muscular de Duchenne, Distrofia Muscular de Becker, Distrofia Muscular de Emer y -Dreifuss, Distrofia Muscular de Limb-Girdle, Distrofia Muscular Fasciocapulohumeral, Distrofia Muscular Miotónica, Distrofia Muscular Oculofaríngea, Distrofia Muscular Distal y Distrofia Muscular Congénita.

22. Un polipéptido ActRIIB de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica.

23. Un polipéptido ActRIIB de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de un trastorno de desgaste muscular, en el que el trastorno de desgaste muscular se selecciona entre el grupo que consiste en caquexia, anorexia, síndrome DMD, síndrome BMD, síndrome de desgaste por SIDA, distrofias musculares, enfermedades neuromusculares, enfermedades de neurona motora, enfermedades de la unión neuromuscular y miopatías inflamatorias.

24. Un polipéptido ActRIIB de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, en el que el trastorno neurodegenerativo se selecciona entre el grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer (EA) , enfermedad de Parkinson (EP) , esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , enfermedad de Huntington (EH) .

25. Un polipéptido ActRIIB de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con una ganancia de peso corporal no deseada, en el que dicho trastorno se selecciona entre el grupo que consiste en obesidad, diabetes mellitus no dependiente de insulina (DMNDI) , enfermedad cardiovascular, cáncer, hipertensión, osteoartritis, ictus, problemas respiratorios y enfermedad de la vesícula biliar.

26. Un polipéptido ActRIIB de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con una actividad anormal de GDF-8, en el que el trastorno asociado con una actividad anormal de GDF-8 se selecciona entre el grupo que consiste en: trastornos metabólicos, tales como diabetes de tipo 2, tolerancia de glucosa alterada, síndrome metabólico (por ejemplo, síndrome X) , y resistencia a insulina inducida por trauma (por ejemplo quemaduras o desequilibrio de nitrógeno) ; trastornos de tejido adiposo (por ejemplo, obesidad) , distrofia muscular (incluyendo distrofia muscular de Duchenne) ; esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ; atrofia muscular; atrofia de órganos; debilidad; síndrome del túnel carpiano, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, sarcopenia, caquexia, y otros síndromes de desgaste muscular, osteoporosis; osteoporosis inducida por glucocorticoides; osteopenia; osteoartritis; fracturas relacionadas con osteoporosis, masa ósea de bajo nivel debido a terapia glucocorticoide crónica, fallo gonadal prematuro, supresión de andrógenos, deficiencia de vitamina D, hiperparatiroidismo secundario, deficiencias nutricionales y anorexia nerviosa.