Plantas de tomate que tienen niveles más elevados de resistencia a Botrytis.

Planta de tomate de Lycopernicon esculentum resistente a Botrytis,

producida mediante un método quecomprende la etapa de transferir desde una planta de tomate donadora resistente a Botrytis a una planta de tomatereceptora susceptible a Botrytis un ácido nucleico que comprende un QTL asociado con resistencia a Botrytis, en laque dicho QTL está asociado con una incidencia de la enfermedad reducida, en la que dicho QTL es el QTL en elcromosoma 4 de Lycopersicon hirsutum LYC 4/78, en la que dicho QTL está indicado por marcadores AFLP ligadosa dicho QTL, en la que el QTL en los cromosomas 4 de Lycopersicon hirsutum LYC 4/78 está indicado por losfragmentos de AFLP P18M51-169.5e, P18M51-305.4h, P14M60-262.9e, P14M61-292.7h, P14M48-345e, P14M48-177e y P18M50-147e y el marcador TG609 en el cromosoma 4 de Lycopersicon hirsutum LYC 4/78,en la que el fragmento de AFLP:

- P18M51-169.5e puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuenciasGACTGCGTACATGCAGCT y GATGAGTCCTGAGTAACCA que dan como resultado un fragmento de ALFP deltamaño aproximado (± 2 pares de bases) de 169,5 tal como se amplifica en L. esculentum cv Moneymaker;

- P18M51-305.4h puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuenciasGACTGCGTACATGCAGCT y GATGAGTCCTGAGTAACCA que dan como resultado un fragmento de ALFP deltamaño aproximado (± 2 pares de bases) de 305,4 tal como se amplifica en L. hirsutum LYC 4/78;

- P14M60-262.9e puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuenciasGACTGCGTACATGCAGAT y GATGAGTCCGAGTAACTC que dan como resultado un fragmento de ALFP deltamaño aproximado (± 2 pares de bases) de 262,9 tal como se amplifica en L. esculentum cv Moneymaker;

- P14M61-292.7h puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuenciasGACTGCGTACATGCAGAT y GATGAGTCCTGAGTAACTG que dan como resultado un fragmento de ALFP deltamaño aproximado (± 2 pares de bases) de 292,7 tal como se amplifica en L. hirsutum LYC 4/78;-

El marcador TG609 es el marcador RFLP que puede obtenerse mediante amplificación utilizando el cebadordirecto que tiene la secuencia (5'-3')**Fórmula**

y utilizando el cebador inverso que tiene la secuencia.

Plantas de tomate que tienen niveles mas elevados de resistencia a Botr y tis

SECTOR TECNICO La presente invención se refiere a fitomejoramiento y biologia molecular. Mas especificamente, la presente invención se refiere a un metodo para detectar un locus de rasgo cuantitativo (QTL) asociado con resistencia a Botr y tis cinerea en tomate, a un metodo de producción de una planta de tomate resistente a Botr y tis con ello y a plantas de tomate resistentes a Botr y tis obtenidas de este modo y partes de las mismas. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Botr y tis cinerea es un hongo patógeno necrotrófico con un rango de huespedes excepcionalmente amplio que comprende, como minimo, 235 posibles huespedes. Debido a su amplio rango de huespedes y debido a que afecta económicamente a partes importantes de la planta, B. cinerea es un problema fundamental en muchos cultivos de desarrollo comercial. Entre los agricultores, el hongo se denomina habitualmente como Botr y tis. El tomate cultivado (principalmente Lycopersicon esculentum) tambien es susceptible a infección por Botr y tis y el hongo generalmente afecta al tallo, las hojas y el fruto de la planta de tomate. En invernaderos calefactados la aparición de infecciones por Botr y tis en los tallos es particularmente habitual. Botr y tis mata activamente las celulas infectadas, causando podredumbre humeda, chancros, mancha foliar, mal de los semilleros y canceres de tallo. Las hojas afectadas quedan cubiertas por conidi6foros y conidios, y posteriormente se repliegan y se marchitan. El hongo crecera a partir de hojas enfermas en el tallo y producira lesiones secas, de color marrón claro de unos pocos milimetros a varios centimetros de longitud. Las lesiones tambien pueden formarse en cicatrices de poda en el tallo. Las lesiones del tallo tambien pueden estar cubiertas con un moho gris. En casos graves, la infección rodea al tallo y mata a la planta. El tejido mas viejo, senescente, de una planta de tomate es habitualmente mas susceptible al ataque por Botr y tis que el tejido mas joven. Para prevenir el desarrollo de Botr y tis en tomates cultivados en invernadero, la temperatura y la humedad relativa deben estar reguladas estrechamente. Es importante, ademas, proporcionar agua sin humedecer las hojas. Para plantas cultivadas en el campo, deben emplearse un buen drenaje y control de las malas hierbas. Ademas, los niveles de nutrientes de las plantas deben mantenerse elevados. Sin embargo, estas medidas preventivas no pueden evitar completamente la aparición de perdidas de rendimiento considerables en caso de infección.

Estan disponibles fungicidas para controlar a Botr y tis en tomates cultivados tanto en invernadero como en el campo. Los ejemplos de algunos fungicidas incluyen Dowicide A® y clorotalonil, que tambien pueden aplicarse a los frutos de tomate despues de la cosecha. Sin embargo, se sabe que Botr y tis ha desarrollado resistencia contra varios fungicidas utilizados habitualmente. Ademas, la utilización de fungicidas no se desea desde una perspectiva tanto económica como medioambiental. Actualmente, existe una necesidad de variedades comerciales de tomate que muestren resistencia a Botr y tis. Se ha descubierto resistencia parcial a Botr y tis en varias especies silvestres de Lycopersicon (Egashira y otros 2000; Nicot y otros 2002; Urbasch 1986) . Estas plantas, sin embargo, no producen tomates de cultivo comerciales.

Es conocido del documento WO 02/085105 que L. hirsutum comprende una región genetica en el cromosoma 10 del genoma que esta implicada en la resistencia parcial a Botr y tis. Se cree que la introgresión de este material genetico en variedades cultivadas de tomate es capaz de proporcionar plantas cultivadas de tomate que son parcialmente resistentes a Botr y tis. Hasta ahora, sin embargo, los programas de obtención dirigidos a proporcionar resistencia a Botr y tis en tomate han tenido un exito limitado. La razón para estos malos resultados actualmente no esta clara. Por un lado, esto puede deberse al insuficiente conocimiento de la base genetica y la herencia de la resistencia a Botr y tis. Por otro lado, esto puede deberse a la falta de bioensayos apropiados para evaluar los niveles de resistencia a Botr y tis en plantas de 55 tomate obtenidas en programas de obtención. La falta de conocimiento y de metodos tambien complica la selección de plantas tanto entre numeros de registro de adquisiciones silvestres como plantas de la descendencia que comprenden genes implicados en la resistencia a Botr y tis. Es un objetivo de la presente invención mejorar el exito de programas de obtención dirigidos a proporcionar variedades comerciales de tomate que son resistentes a Botr y tis. Es un objetivo adicional de la presente invención proporcionar resistencia adicional y/o mejorada a Botr y tis en variedades comerciales de tomate. Es otro objetivo mas de la presente invención dar a conocer un metodo para descubrir numeros de registro de adquisiciones de Lycopersicon silvestre adicionales como fuentes de resistencia a Botr y tis y para descubrir material genetico adicional en el genoma de dichas plantas que esta implicado en la resistencia del tomate a Botr y tis. Dichas fuentes 65 adicionales y material genetico adicional pueden utilizarse para ampliar la base para la producción de variedades resistentes a Botr y tis de tomate cultivado.

CARACTERiSTICAS DE LA INVENCION

Los inventores de la presente invención han descubierto actualmente que un bioensayo cuantitativo particular que comprende la medición de parametros iniciales y/o progresivos de infección con Botr y tis en plantas de tomate en combinación con una tecnica de detección de un marcador molecular proporciona un metodo muy ventajoso para detectar fuentes de resistencia a Botr y tis entre numeros de registro de adquisiciones de Lycopersicon silvestres y para detectar material genetico en el genoma de dichas plantas que esta implicado en resistencia mejorada de tomate a Botr y tis.

Utilizando esta combinación de tecnicas, los inventores de la presente invención han identificado con exito resistencia parcial a Botr y tis en dos lineas de parientes silvestres del tomate, es decir Lycopersicon hirsutum LYC 4/ º8y Lycopersicon parviflorum G1.1601.

Los inventores fueron capaces posteriormente de producir plantas de tomate resistentes a Botr y tis cruzando plantas de esas lineas de tomate (donadoras) silvestres resistentes a Botr y tis con plantas de tomate receptoras no resistentes. Estas plantas mostraban un nivel mas elevado de resistencia que las plantas que comprenden una región genómica en el cromosoma 10 de L. hirsutum asociada con resistencia a Botr y tis, tal como se da a conocer en el documento WO 02/085105.

Evaluando el nivel de resistencia a Botr y tis en poblaciones segregantes (poblaciones F2) de estos cruces recien producidos en relación con la presencia de marcadores moleculares de la planta donadora, los inventores de la presente invención fueron capaces de identificar multiples loci de rasgo cuantitativo (QTL) ligados con resistencia a Botr y tis en las lineas silvestres de tomate resistentes y, de este modo, establecer la ubicación de multiples secuencias de ADN que otorgan resistencia en el genoma. Como resultado, los inventores de la presente invención han descubierto ahora que la resistencia a Botr y tis en tomate se hereda de forma poligenica, lo que puede explicar parcialmente los malos resultados de obtención. Este descubrimiento proporciona la mejora de metodos de producción de plantas de tomate resistentes a Botr y tis. Mas adelante en la descripción, un locus de rasgo cuantitativo (QTL) asociado con resistencia a Botr y tis en tomate sera denominado de forma abreviada como un QTL para resistencia a Botr y tis o un QTL asociado con resistencia a Botr y tis.

Un total de seis nuevos QTL para resistencia a Botr y tis se descubrieron en las dos lineas de tomate silvestre. Cuatro de estos seis QTL podrian estar ligados a un parametro cuantitativo que reflejaba la capacidad de la planta para reducir el establecimiento inicial de una infección, denominado en lo sucesivo en el presente documento como el parametro para incidencia de la enfermedad. Dos de estos seis QTL podrian estar ligados a un parametro cuantitativo que reflejaba la capacidad de la planta para ralentizar el avance de la infección, denominado en lo sucesivo en el presente documento como el parametro para la tasa de crecimiento de la lesión.

Produciendo mapas de ligamiento genetico, se descubri6 que el cromosoma 1 de L. hirsutum LYC 4/ º8 alberga un QTL que esta ligado con una tasa de crecimiento reducida de lesiones inducidas por infección por Botr y tis y que ambos cromosomas 2 y 4 de ese mismo numero de registro de adquisiciones albergan un QTL que esta ligado con una incidencia de enfermedad reducida.... [Seguir leyendo]

1. Planta de tomate de Lycopernicon esculentum resistente a Botr y tis, producida mediante un metodo que comprende la etapa de transferir desde una planta de tomate donadora resistente a Botr y tis a una planta de tomate 5 receptora susceptible a Botr y tis un acido nucleico que comprende un QTL asociado con resistencia a Botr y tis, en la que dicho QTL esta asociado con una incidencia de la enfermedad reducida, en la que dicho QTL es el QTL en el cromosoma 4 de Lycopersicon hirsutum LYC 4/ 8, en la que dicho QTL esta indicado por marcadores AFLP ligados a dicho QTL, en la que el QTL en los cromosomas 4 de Lycopersicon hirsutum LYC 4/ º8 esta indicado por los fragmentos de AFLP P18M51º 169.5e, P18M51º 305.4h, P14M60º 262.9e, P14M61 292. ºh, P14M48 345e, P14M48

1ººe y P18M50 14ºe y el marcador TG609 en el cromosoma 4 de Lycopersicon hirsutum LYC 4/º 8, en la que el fragmento de AFLP:

P18M51º 169.5e puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuencias GACTGCGTACATGCAGCT y GATGAGTCCTGAGTAACCA que dan como resultado un fragmento de ALFP del 15 tamafo aproximado (± 2 pares de bases) de 169, 5 tal como se amplifica en L. esculentum cv Moneymaker;

P18M51º 305.4h puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuencias GACTGCGTACATGCAGCT y GATGAGTCCTGAGTAACCA que dan como resultado un fragmento de ALFP del tamafo aproximado (± 2 pares de bases) de 305, 4 tal como se amplifica en L. hirsutum LYC 4/º 8;

P14M60º 262.9e puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuencias 20 GACTGCGTACATGCAGAT y GATGAGTCCGAGTAACTC que dan como resultado un fragmento de ALFP del tamafo aproximado (± 2 pares de bases) de 262, 9 tal como se amplifica en L. esculentum cv Moneymaker;

P14M61º 292. h puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuencias GACTGCGTACATGCAGAT y GATGAGTCCTGAGTAACTG que dan como resultado un fragmento de ALFP del tamafo aproximado (± 2 pares de bases) de 292, tal como se amplifica en L. hirsutum LYC 4/º 8;

El marcador TG609 es el marcador RFLP que puede obtenerse mediante amplificación utilizando el cebador directo que tiene la secuencia (5' 3')

y utilizando el cebador inverso que tiene la secuencia dando como resultado un fragmento de RFLP de 1900 pares de bases que tiene un sitio de corte PST1; P14M48 345e puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuencias 5 GACTGCGTACATGCAGAT y GATGAGTCCTGAGTAACAC que dan como resultado un fragmento de ALFP del tamafo aproximado (± 2 pares de bases) de 345 tal como se amplifica en L. esculentum cv Moneymaker;

P14M48 1ººe puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuencias GACTGCGTACATGCAGAT y GATGAGTCCTGAGTAACAC que dan como resultado un fragmento de ALFP del tamafo aproximado (± 2 pares de bases) de 1º tal como se amplifica en L. esculentum cv Moneymaker;

P18M50 14ºe puede obtenerse mediante amplificación utilizando los cebadores que tienen las secuencias GACTGCGTACATGCAGCT y GATGAGTCCTGAGTAACAT que dan como resultado un fragmento de ALFP del tamafo aproximado (± 2 pares de bases) de 14 tal como se amplifica en L. esculentum cv Moneymaker;

en la que dicha transferencia de dicho acido nucleico se realiza mediante cruzamiento, mediante transformación, 15 mediante fusión de protoplastos, mediante una tecnica de dobles haploides o mediante rescate embrionario, y en la que dicho QTL no esta en su contexto genetico natural.

2. Planta de tomate resistente a Botr y tis, segun la reivindicación 1, en la que dicha planta de tomate donadora resistente a Botr y tis se selecciona entre el grupo que comprende Lycopersicon cerasiforme, Lycopersicon cheesmanii, Lycopersicon chilense, Lycopersicon chmielewskii, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon hirsutum, Lycopersicon parviflorum, Lycopersicon pennellii, Lycopersicon peruvianum, Lycopersicon pimpinellifolium y Solanum lycopersicoides.

3. Planta de tomate resistente a Botr y tis, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 2, en la que dicha planta de tomate donadora resistente a Botr y tis es un numero de registro de adquisiciones silvestre de Lycopersicon hirsutum, mas preferentemente Lycopersicon hirsutum LYC 4/º 8.

4. Planta de tomate resistente a Botr y tis, segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 3, en la que dicha planta de tomate receptora susceptible a Botr y tis es una planta de una linea de L. esculentum que posee caracteristicas 30 deseables desde el punto de vista comercial.

5. Metodo de producción de una planta de tomate de Lycopersicon esculentum resistente a Botr y tis que comprende la etapa de transferir un acido nucleico que comprende, como minimo, un QTL, segun la reivindicación 1, en el que dicho QTL esta indicado mediante, como minimo, un marcador seleccionado entre el grupo que comprende los marcadores, segun la reivindicación 1, desde una planta de tomate donadora resistente a Botr y tis a una planta de tomate de Lycopersicon esculentum receptora susceptible a Botr y tis, en el que dicha transferencia de acido nucleico se realiza mediante transformación, y en el que dicha transferencia no implica procesos esencialmente biológicos.

6. Planta de tomate de Lycopersicon esculentum resistente a Botr y tis, o parte de la misma, que comprende dentro de su genoma un QTL, segun la reivindicación 1, asociado con resistencia a Botr y tis, y en la que dicho QTL no esta en su contexto genetico natural, y en la que dicho QTL esta indicado por los marcadores ligados a dichos QTL, segun la reivindicación 1.

º. Planta de tomate de L. esculentum hibrida, o parte de la misma, que puede obtenerse cruzando una planta de tomate, segun la reivindicación 6, con una planta de tomate que muestra caracteristicas deseables desde el punto de vista comercial, y que comprende dentro de su genoma dicho QTL, segun la reivindicación 1, asociado con resistencia a Botr y tis.

8. Semilla de tomate producida cultivando la planta de tomate, segun una cualquiera de las reivindicaciones 6 6 , comprendiendo dicha semilla dentro de su genoma dicho QTL, segun la reivindicación 1, asociado con resistencia a Botr y tis.

9. Semilla de tomate producida retrocruzando la planta, segun la reivindicación , con una planta de L. esculentum que tiene rasgos fenotipicos deseables para obtener una planta de L. esculentum que es resistente a Botr y tis y tiene rasgos fenotipicos deseables, y recogiendo las semillas producidas por dicha planta, comprendiendo dicha semilla dentro de su genoma dicho QTL, segun la reivindicación 1, asociado con resistencia a Botr y tis.

10. Utilización de un QTL, segun la reivindicación 1, asociado con resistencia a Botr y tis, y en la que dicho QTL no esta en su contexto genetico natural, y en la que dicho QTL esta indicado por los marcadores ligados a dicho QTL, segun la reivindicación 1, para la producción de plantas de tomate de L. esculentum resistentes a Botr y tis, donde dicha utilización no implica procesos esencialmente biológicos.

11. Utilización de un marcador, segun la reivindicación 1, para la detección de plantas de tomate de L. esculentum resistentes a Botr y tis.