Perlas para el análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento.

Perla que comprende por lo menos dos cebadores de amplificación específicos de secuencia,

en la que uncebador se encuentra unido a dicha perla con un conector cortable inducible mediante la reacción entre un grupoamino funcional de dicho cebador y una fracción carboxi-funcional de dicha perla, y en la que dicho cebadorcomprende además una etiqueta detectable.

Perlas para el análisis de ácidos nucleicos de alto rendimiento La presente invención se refiere al campo del análisis de ácidos nucleicos y en particular de la detección miniaturizada altamente en paralelo de secuencias de ácidos nucleicos y del análisis de las diferencias entre secuencias de ácidos nucleicos.

La invención se basa en la idea de proporcionar un soporte sólido al que se unen cebadores específicos de secuencia, siendo uno cortable y el otro siendo no cortable, con el fin de analizar secuencias específicas o de detectar la presencia de una SNP, una mutación o cualquier especie de ADN o ARN de interés.

Antecedentes de la técnica

Recientemente, se ha dado a conocer un sistema de secuenciación de rendimiento ultraelevado que se basa en la secuenciación de pirofosfatos, que permite la secuenciación de un genoma bacteriano en esencialmente no más de una semana (documentos WO nº 04/70007 y nº 05/03375; Margulies M. et al., Nature 437:376-80, 2005) . Partiendo de ADN genómico fragmentado, se unen fragmentos de una sola molécula a perlas que se capturan en una emulsión en aceite de mezcla de reacción de PCR. La amplificación resulta en una biblioteca de ADN amplificado clonalmente en la que cada perla porta múltiples copias del mismo fragmento.

Tras romper la emulsión y desnaturalizar los productos de PCR en cadenas sencillas, las perlas se depositan en los múltiples pocillos de una placa de picotitulación de fibra óptica, de manera que cada pocillo contenga no más de una sola perla. A continuación, en una reacción de secuenciación mediante síntesis, se lleva a cabo una reacción de extensión de cebador en la que los 4 nucleósidos trifosfato diferentes, A, G, C y T, o los análogos respectivos de los mismos, se suministran en una serie repetitiva de sucesos y la secuencia de la cadena naciente se infiere a partir de productos químicos derivados de la reacción de extensión catalizada por la ADN polimerasa. En particular, la reacción de secuenciación mediante síntesis es una reacción de secuenciación de pirofosfato, caracterizada porque la generación de pirofosfato se detecta de la manera siguiente:

PPi + adenosín-5’-fosfosulfato (APS) ATP, catalizada en presencia de apirasa, ATP + luciferina luz + oxiluciferina, catalizada en presencia de luciferasa. Detección de la luminiscencia de la oxiluciferina.

Con el sistema de secuenciación de rendimiento ultraelevado dado a conocer en los documentos WO nº 04/70007 y nº 05/03375, pueden llevarse a cabo simultáneamente más de 1.000.000 reacciones de secuenciación de pirofosfato. La generación de pirofosfato desencadena una cascada de reacción luminiscentes y finalmente se detecta la luz con una cámara CCD.

Con respecto a esta tecnología, el documento WO nº 04/69849 da a conocer un método para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo cada secuencia de una biblioteca de ADN, transcriptoma o genoma) de una manera rápida y económico en un solo tubo de reacción. Más particularmente, el documento WO nº 04/69849 da a conocer una amplificación clonal simultánea (por ejemplo mediante PCR) de una pluralidad de muestras (hasta varios cientos de miles) en un recipiente de reacción. En el presente contexto, el documento WO nº 04/69849 proporciona unos medios para encapsular una pluralidad de muestras de ADN individualmente en una microcápsula de una emulsión (es decir, un microrreactor) , llevando a cabo la amplificación de la pluralidad de muestras encapsuladas de ácidos nucleicos simultáneamente, y liberando dicha pluralidad amplificación de ADN de las microcápsulas para reacciones posteriores. Por ejemplo, se hibridan copias individuales de la especie de ácido nucleico molde en perlas de captura que comprenden, por ejemplo, oligonucleótidos de captura o grupos químicos que se unen al ácido nucleico molde. Las perlas se suspenden en solución de amplificación completa y se emulsionan produciendo microrreactores (típicamente de 100 a 200 micrómetros de diámetro) . A continuación, se utiliza la amplificación (por ejemplo la PCR) para incrementar clonalmente el número de copia de la especie de molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores. Alternativamente, se añaden perlas de captura a una mezcla de reacción de amplificación que comprende ácido nucleico molde y esta mezcla se emulsiona para producir microrreactores. La amplificación (por ejemplo la PCR) se utiliza para incrementar clonalmente el número de copia de la especie de molde inicial en los microrreactores, y estas copias se unen a las perlas de captura en los microrreactores. De esta manera, los microrreactores según el documento WO nº 05/03375 permiten la amplificación clonal y discreta simultánea de muchos moldes diferentes sin contaminación cruzada de los productos amplificados o reactivos, o el dominio de un molde o conjunto de moldes particular (por ejemplo el sesgo de PCR) .

Sin embargo, según el documento WO nº 05/03375 resulta necesario llevar a cabo una etapa de ligación de adaptador en la que una secuencia adaptadora a una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos diferentes que posteriormente puede unirse a una perla con una secuencia adaptadora complementaria unida covalentemente.

Otra técnica importante de análisis del ADN es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) analítica. Sin embargo, la cuantificación mediante PCR hasta el momento se basa en modos de medición análogos. Sin embargo, en algunos casos resultaría altamente deseable un principio de recuento digital, por ejemplo en áreas tales como - la detección del cáncer: la cuantificación de alelos mutantes en un fondo de exceso de tipo salvaje, - la detección de desequilibrios alélicos, - la expresión génica de transcritos raros y/o alelos mutantes en transcritos, - la detección y cuantificación víricas.

De esta manera, la disponibilidad de un recuento digital de ADN/ADNc/ARNm cumple necesidades no satisfechas de la medicina molecular, por ejemplo altamente relevantes para el diagnóstico del cáncer, de células tumorales circulantes, de células embrionarias prenatales en las que debe detectarse un suceso específico dentro de un fondo elevado.

Por lo tanto, era un objetivo de la presente invención proporcionar un método mejorado y reactivos mejorados para el análisis simultáneo de múltiples moléculas de ácidos nucleicos.

En un aspecto particular era un objetivo de la presente invención proporcionar un soporte sólido o una pluralidad de soportes sólidos que pueden utilizarse para mejorar el flujo de trabajo de secuenciación indicado anteriormente o permitir el recuento digital de PCR.

Son bien conocidos de la técnica diversos soportes sólidos que comprenden ácidos nucleicos inmovilizados, tales como perlas que comprenden oligonucleótidos inmovilizados. El diseño y configuración exactos de estas perlas dependen de la aplicación para la que se utilizan: G. Steinberg-Tatman et al. (Bioconjugate Chemistr y 17:841-848, 2006) describen un método para sintetizar perlas con dos oligonucleótidos diferentes unidos a la superficie mediante un conector no cortable. Un oligonucleótido se utiliza como sonda de captura específica de secuencia y la otra como secuencia decodificadora.

La patente US nº 5639603 describe perlas con una o más etiquetas oligonucleótidas decodificadoras inmovilizadas.

Xu X. et al., Journal of the American Chemical Society 128:9286-9287, 2006, describen partículas de oro con dos oligonucleótidos diferentes unidos a la superficie para la construcción de nanoestructuras multipartícula ordenadas.

El documento WO nº 2001/062982 y la patente US nº 5.641.658 describen PCR sobre superficies de perlas con dos cebadores inmovilizados. El método de PCR se denomina amplificación de puentes.

El documento WO nº 2001/012862 describe un método para generar una agrupación de oligonucleótidos mediante el corte de diferentes oligonucleótidos que se encuentran unidos a un sustrato mediante diferentes conectores cortables.

El documento WO nº 2007/111937 describe una matriz para parejas de cebadores en la que por lo menos un cebador se une mediante un enlace cortable para el enriquecimiento de ADN genómico utilizado en la secuenciación. Se dan a conocer ejemplos adicionales de enlace cortable en los documentos WO nº 07/081387 y nº 07/136736.

El documento KR nº 2007/044677 describe perlas con un primer y un segundo cebadores de PCR inmovilizados para la utilización en PCR en emulsión. El primer cebador es no cortable. La liberación del segundo cebador se consigue modificando el valor del pH. Sin embargo, la modificación del valor del pH presenta... [Seguir leyendo]

1. Perla que comprende por lo menos dos cebadores de amplificación específicos de secuencia, en la que un cebador se encuentra unido a dicha perla con un conector cortable inducible mediante la reacción entre un grupo amino funcional de dicho cebador y una fracción carboxi-funcional de dicha perla, y en la que dicho cebador comprende además una etiqueta detectable.

2. Perla según la reivindicación 1, en la que dicha perla está compuesta de un material seleccionado de entre el grupo que consiste de silicio, dióxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de lantánido, vidrio, silicatos, poliestireno, celulosa, sefarosa y poliamida.

3. Perla según la reivindicación 2, en la que dicho conector cortable es un conector fotocortable.

4. Biblioteca de perlas según las reivindicaciones 1 a 3.

5. Biblioteca según la reivindicación 4, caracterizada porque cada elemento de la pluralidad de cebadores que se encuentran unidos a la perla mediante un conector cortable porta una etiqueta detectable diferente.

6. Método para preparar una perla según las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

- proporcionar una perla que porta por lo menos un grupo funcional, y

- hacer reaccionar dicho grupo o grupos funcionales con el grupo o grupos reactivos de dos cebadores específicos de secuencia, en los que una fracción reactiva cortable se encuentra presente en uno de los espaciadores que conecta dicho soporte sólido con su grupo funcional o se encuentra presente uno de sus grupos funcionales o dicha fracción cortable dentro de uno de los espaciadores que conecta uno de dichos cebadores específicos de secuencia con su grupo reactivo.

7. Método según la reivindicación 6, que comprende:

- proporcionar una perla que comprende dos grupos funcionales, portando cada uno, un grupo protector diferente,

- desproteger un primer grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con el grupo reactivo de un primer cebador,

- desproteger el segundo grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo de dicha perla con el grupo reactivo de un segundo cebador.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dichos dos grupos funcionales se encuentran conectados a la perla mediante un conector de dos brazos.

9. Método según la reivindicación 6, que comprende:

- proporcionar una perla que porta exactamente un grupo funcional,

- desproteger dicho grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con una mezcla de un primer y un segundo cebadores específicos de secuencia, comprendiendo dichos primer y segundo cebadores, grupos reactivos idénticos, caracterizado porque uno de dichos cebadores se conecta con su grupo reactivo mediante una fracción cortable.

10. Método según la reivindicación 6, que comprende:

- proporcionar una perla que porta exactamente un grupo funcional, - desproteger dicho grupo funcional y hacer reaccionar dicho grupo con un oligonucleótido que representa un primer y un segundo cebadores de amplificación que se encuentran conectados mediante una fracción cortable.