Péptido antagonista del receptor B2 de bradiquinina proveniente de la piel de un anfibio.

Un péptido aislado que tiene actividad antagonista de bradiquinina,

en el que dicho péptido comprende lasecuencia de aminoácidos:

-pGlu-Ile-Pro-Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.NH2 (ID de Secuencia Nº: 3); o

-Gln-Ile-Pro 5 -Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.

Péptido antagonista del receptor B2 de bradiquinina proveniente de la piel de un anfibio Campo de la invención La presente invención se refiere a péptidos y uso de los mismos. En particular, se refiere a moléculas antagonistas 5 de bradiquinina.

Introducción La serie formidable de moléculas bioactivas, incluyendo péptidos, presentes en piel de anfibio, ha sido objeto de estudio durante aproximadamente 40 años (Erspamer, V. (1984) Comp. Biochem. Physiol. 79C, 1-7) . La fuente de estos cócteles moleculares son las glándulas venenosas o granulares especializadas, que como respuesta a estrés 10 o ataque de un depredador, se secretan a la superficie de la piel (Erspamer, V., Melchiorri, P., Falconieri Erspamer,

G. F., Montecucchi, P.P y De Castiglione R. (1985) Peptides 6Supl. 3, 7-12) . Desde los estudios pioneros sobre los péptidos de piel de anfibio por Vittorio Erspamer, se han caracterizado estructuralmente varios cientos de péptidos y se han clasificado en familias en base a similitudes estructurales, por ejemplo, bombesina, taquiquininas y bradiquininas (Lazarus, L. H. y Atilla, M. (1993) Prog. Neurobiol. 41, 473-507) .

Las bradiquininas se encuentran en las secreciones de la piel de muchos anfibios anuros incluyendo especies representativas de las familias Ranidae, Hylidae y Bombinatoridae (Conlon, J. M. y Aronsson, U. (1997) Peptides 18, 361-365; Yasuhara, T., Ishikawa, O., Nakajima, T., Araki, K. y Tachibana, S. (1979) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 27, 486-491; Anastasi, A., Bertaccini, G. y Erspamer, V. (1966) Br. J. Pharmacol. 27, 479-485; Yasuhara, T., Hira, M., Nakajima, T., Yanaihara, N. y Yanaihara, C. (1973) Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 21, 1388-139; Lai R., Liu H., Hui Lee W. y Zhang Y. (2 001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 286, 259-263) .

Las acciones de bradiquinina son diversas, incluyendo vasodilatación con hipotensión inducida posterior, aumento de la permeabilidad vascular, inducción de dolor y contracción de una diversidad de tipos de músculo liso (Regoli, D., Rizzi, A. y Cab, G. (1997) Pharmacol. Res. 35, 513-515) . Sin embargo, las acciones de algunas variantes estructurales tales como filoquinina (bradiquinil-IYsulfato de Phyllomedusa sp.) con frecuencia son más potentes y 25 prolongadas, por ejemplo sobre la inducción de vasodilatación/hipotensión (Anastasi, A., Bertaccini, G. y Erspamer,

V. (1966) Br. J. Pharmacol. 27, 479-485) .

A diferencia de la estrategia de administración suprafisiológica de agonistas de bradiquinina evolucionados en anfibios, las serpientes hemotóxicas son bastante diferentes. Los venenos de estos reptiles son una fuente rica de péptidos pequeños que potencian la acción de bradiquinina sobre el músculo liso vascular de mamífero inhibiendo la enzima convertidora de angiotensina (ACE) (Higuchi, S., Murayaraa, N., Saguchi, K., Ohi, H., Fujita, Y., Camargo, A. CM., Ogawa, T., Deshimaru, M. y Ohno, M. (1999) Immunopharmacology 44, 12 9-135) . Los péptidos tipo, del veneno de la víbora Brasileña, Bothrops jararaca, fueron los compuestos líderes en el desarrollo de fármaco inhibidor de ACE que son actualmente el pilar principal en el tratamiento de hipertensión (Moser, M. (2002) J. Hypertension 20, S3-S10) .

La solicitud PCT WO8607263 divulga un péptido RPPGLGfLR, que es un antagonista de receptor de bradiquinina. El péptido es un derivado de la bradiquinina de mamífero.

No teniendo conocimiento de ningún estudio previo dirigido a determinar se existían análogos de piel de anfibio para péptidos potenciadores de bradiquinina del veneno de reptil, los inventores se embarcaron en un estudio sistemático diseñado para abordar esta cuestión.

Compendio de la invención De forma sorprendente, en su investigación en busca de un péptido potenciador de bradiquinina de anfibio, los presentes inventores han encontrado un péptido antagonista del receptor de bradiquinina en la secreción de la piel del sapo Chino, Bombina maxima. Este péptido, denominado en lo sucesivo en la presente memoria quinestatina, representa una clase estructural completamente novedosa de péptido de piel de anfibio que tiene una actividad

inhibidora de bradiquinina única.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un péptido aislado como se expone en la reivindicación 1.

En realizaciones particularmente preferidas de la invención, el péptido de y para su uso en los métodos de la invención comprende la secuencia de aminoácidos:

pGlu-Ile-Pro-Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.NH2 (SEC ID Nº: 3) .

El péptido de la invención puede ser de cualquier longitud, siempre y cuando conserve la actividad inhibidora de bradiquinina. Preferentemente, el péptido de y para su uso en la invención tiene actividad antagonista del receptor B2. Sin embargo, en realizaciones preferidas, el péptido es un nonapéptido. En una realización particularmente

preferida, el péptido es un nonapéptido que tiene una secuencia de aminoácidos:

pGlu-Ile-Pro-Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.NH2 (SEC ID Nº: 3) .

Se ha de comprender que los péptidos de acuerdo con el primer aspecto de la invención abarcan péptidos sin modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, un péptido que tiene la secuencia correspondiente a la de SEC ID Nº: 3 en la cual el extremo C no está amidado y la glutamina N terminal no se ha ciclado para formar piroglutamato se incluye en la invención. Sin embargo, se prefieren los péptidos que tienen tales modificaciones postraduccionales.

Un péptido se considera que tiene actividad antagonista de bradiquinina si en un receptor de bradiquinina definido que contiene preparación farmacológica, el péptido puede inhibir eficazmente la actividad farmacológica de bradiquinina. En realizaciones preferidas, el péptido puede inhibir eficazmente la actividad farmacológica de bradiquinina selectivamente en los receptores B2 de bradiquinina.

Como un segundo aspecto, la invención proporciona además un polinucleótido aislado que codifica un péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención. En una realización preferida, el polinucleótido comprende la secuencia:

CAAATTCCIGGTTTAGGCCCTCTGCGT (SEC ID Nº: 5) .

Aunque los polinucleótidos de la invención generalmente se encuentran en forma aislada, los mismos pueden estar integrados con otras moléculas genéticas, tales como una molécula de vector. Por consiguiente, en un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de vector que comprende un polinucleótido aislado del segundo aspecto de la invención.

Además, la invención proporciona en un cuarto aspecto un método in vitro para antagonizar la actividad de bradiquinina en una célula o tejido, comprendiendo dicho método administrar un péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, un polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención a dicha célula o tejido.

De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención se proporciona un método in vitro para constreñir músculo liso vascular, comprendiendo dicho método administrar un péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, un polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención a dicho músculo liso.

La demostración sorprendente de que las quinestatinas muestran actividad de antagonismo de bradiquinina significativa posibilita el uso de tales péptidos y los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo enfermedades del sistema cardiovascular, enfermedades neurológicas o enfermedades degenerativas, tales como enfermedad de Alzheimer.

Por tanto, de acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona un péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, un polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto del la invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención para su uso en un método para tratar una afección asociada con actividad de bradiquinina, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de este tipo a un paciente que lo necesita.

Los péptidos de la invención también se ha observado que inhiben la angiogénesis. Por tanto, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, un polinucleótido de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención para su uso en un método para inhibir la angiogénesis, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz... [Seguir leyendo]

1. Un péptido aislado que tiene actividad antagonista de bradiquinina, en el que dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos:

- pGlu-Ile-Pro-Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.NH2 (ID de Secuencia Nº: 3) ; o -Gln-Ile-Pro-Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho péptido comprende la secuencia de aminoácidos pGlu-lle-Pro-Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.NH2 (ID de Secuencia Nº: 3) .

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el péptido es un nonapéptido.

4. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho péptido consiste en un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos pGlu-lle-Pro-Gly-Leu-Gly-Pro-Leu-Arg.NH2 (ID de Secuencia Nº: 3) .

5. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho péptido tiene actividad antagonista de receptor B2 de bradiquinina selectiva.

6. Un péptido multimérico que comprende el péptido de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

7. Un profármaco peptídico que tiene actividad antagonista de bradiquinina o que es capaz de tener actividad antagonista de bradiquinina cuando el péptido se libera a continuación de la administración, en el que dicho profármaco se selecciona entre el grupo que consiste en compuestos que tienen un resto de aminoácido o una cadena polipeptídica de dos o más restos de aminoácidos unidos covalentemente a través de enlaces peptídicos a grupos libres amino, hidroxilo o de ácido carboxílico de un polímero; compuestos que tienen carbonatos, carbamatos, amidas y alquil ésteres enlazados covalentemente a dichos péptidos a través de los ácidos carboxílicos C-terminales y en el que dicho péptido comprende el péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. El profármaco de la reivindicación 7, en el que el profármaco es un conjugado de péptido-polímero, en el que el polímero comprende un resto de polialquilenglicol.

9. El profármaco de la reivindicación 8, en el que el resto de polialquilenglicol comprende un resto de polietilenglicol.

10. Un polinucleótido aislado que codifica el péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 10 que comprende las secuencia: CAAATTCCTGGTTTAGGCCCTCTGCGT (SEC ID Nº: 5) .

12. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 10 o reivindicación 11.

13. Un anticuerpo que tiene especificidad de unión por el péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

14. Un método in vitro para antagonizar la actividad de bradiquinina en una célula o tejido, comprendiendo dicho método administrar un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 a dicha célula o tejido.

15. Un método in vitro para constreñir músculo liso vascular, comprendiendo dicho método administrar un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 a dicho músculo liso.

16. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en medicina.

17. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad de bradiquinina seleccionada entre enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, apoplejía, trauma craneal, edema cerebral postquirúrgico, edema cerebral (general) , edema cerebral citotóxico, migraña, dolor neuropático, prurito, tumores cerebrales, pseudotumor cerebri, glaucoma, hidrocéfalo, trauma de médula espinal, edema de médula espinal, enfermedades neurodegenerativas o lesión cerebral postraumática.

18. Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una afección asociada con actividad de bradiquinina de acuerdo con la reivindicación 17 en el que dicha actividad de bradiquinina está mediada a través de receptores B2 de bradiquinina.

19. Una composición farmacéutica que comprende un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

20. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento del cáncer.

21. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en carcinoma colorrectal, carcinoma gástrico, de tipo de anillo de sello, carcinoma esofágico, de tipo intestinal, de tipo mucinoso, carcinoma pancreático, carcinoma pulmonar, carcinoma mamario, carcinoma renal, carcinoma de vejiga, carcinoma de próstata, carcinoma testicular, carcinoma ovárico, carcinoma de endometrio, carcinoma tiroideo, carcinoma de hígado, carcinoma de laringe, mesotelioma, carcinomas neuroendocrinos, tumores neuroectodérmicos, melanoma, glioma, neuroblastomas, sarcomas, leiomiosarcoma, MFII, fibrosarcoma, liposarcoma, MPNT, condrosarcoma y linfomas.

22. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada entre el grupo que consiste en hemangioma, tumores sólidos, leucemia, metástasis, telangiectasia, psoriasis, escleroderma, granuloma piogénico, angiogénesis miocárdica, enfermedad de Crohn, neovascularización de placa, colaterales coronarios, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de extremidad isquémica, enfermedades corneales, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental, artritis, neovascularización diabética, degeneración macular, curación de heridas, úlcera péptica, enfermedades relacionadas con Helicobacter, fracturas, queloides y vasculogénesis.

23. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de un trastorno ocular seleccionado entre el grupo que consiste en enfermedad neovascular ocular, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de Vitamina A, queratitis atópica, queratitis límbica superior, pterigión, queratitis sicca, penfigoide, queratotomía radial, degeneración macular, miopía supuesta, foseta óptica, desprendimiento de retina crónico, síndrome de hiperviscosidad, trauma al ojo, complicaciones postláser, rubeosis (neovascularización del ángulo) y enfermedades causadas por la proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso.

24. El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el profármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, el polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 o el vector de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada entre el grupo que consiste en inflamación, artritis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, bartonelosis y aterosclerosis.

25. El péptido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que dicho péptido está presente en o conjugado a un liposoma o micropartícula que es de un tamaño adecuado para administración intravenosa pero que se aloja en los lechos capilares.

26. El péptido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en el que dicho péptido es para su uso con un inhibidor de COX-2.

27. Un método para preparar un péptido que comprende expresar un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 10 u 11.

28. El método de la reivindicación 27 en el que el polinucleótido está comprendido en un vector de acuerdo con la reivindicación 12.

29. Una célula huésped que comprende un polinucleótido heterólogo de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 o un vector de acuerdo con la reivindicación 12.