Oligonucleótidos, métodos y kits para detectar Neisseria gonorrhoeae.

Oligonucleótido capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico que presenta SEC ID nº 1 ó nº 2 que comprende un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90%,

preferentemente una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a una de SEC ID nº 3 a nº 27 ó un complemento de las mismas a lo largo de la longitud completa de SEC ID nº 3 a nº 27 ó el complemento de las mismas, presentando dicho oligonucleótido 100 ó menos nucleótidos.

Oligonucleótidos, métodos y kits para detectar Neisseria gonorrhoeae

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y química de los ácidos nucleicos. La invención proporciona métodos y reactivos para detectar patógenos, tales como Neisseria gonorrhoeae y, por consiguiente, se refiere además a los campos del diagnóstico y pronóstico médico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El género Neisseria consiste de bacterias aeróbicas Gram-negativas, incluyendo el patógeno humano N. gonorrhoeae, que es el agente causativo de la gonorrea. Las infecciones por N. gonorrhoeae, que presentan una elevada prevalencia y una baja mortalidad, generalmente se adquieren por contacto sexual y típicamente afectan a las membranas mucosas de la uretra en el varón y al endocérvix en la hembra. Sin embargo, la infección también puede extenderse a otros tejidos. Por ejemplo, una infección genital en el varón puede ascender la uretra y producir síntomas de prostatitis, mientras que en la hembra, una infección por N. gonorrhoeae del cérvix puede extenderse a los conductos de Falopio y finalmente provocar esterilidad, entre otras condiciones, si no se trata. El mecanismo patogénico de N. gonorrhoeae implica la unión de las bacterias a células epiteliales no ciliadas mediante pili. El mecanismo también incluye la producción de endotoxina y proteasas de IgA.

Con frecuencia se observa coinfección de N. gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis. Ambas infecciones son dos casuas conocidas de embarazo ectópico y también pueden conducir a infertilidad si no se tratan. También son causas conocidas de los síndromes clínicos agudos de cervicitis mucopurulenta y enfermedad inflamatoria pélvica. Por lo tanto, la detección de las infecciones por N. gonorrhoeae y C. trachomatis, que pueden ser asintomáticas, especialmente en hembras, presentan consecuencias para los individuos que necesitan tratamiento y para poblaciones más amplias en riesgo de adquirir y propagar adicionalmente las infecciones.

La detección e identificación de las infecciones bacterianas tradicionalmente se ha llevado a cabo mediante procedimientos de aislamiento y determinación de cultivos puros que aplican conocimientos sobre la origen de los especímenes, los requisitos de crecimiento, las características visibles del crecimiento, la morfología microscópica, las reacciones de tinción y las características bioquímicas. Por ejemplo, entre los métodos preexistentes de detección e identificación de las infecciones por N . gonorrhoeae se incluyen la tinción Gram, el cultivo en medio agar selectivo y el ensayo de citocromo oxidasa y de utilización de carbohidratos. Los ensayos serológicos, incluyendo la coaglutinación y la tinción con anticuerpos fluorescentes también han sido descritos para la detección de N. gonorrhoeae. Los métodos basados en cultivos, aunque relativamente sensibles, generalmente resultan de ejecución larga, incluyendo con frecuencia la incubación durante la noche, y son laboriosos. La tinción Gram y los ensayos basados en anticuerpos típicamente proporcionan resultados en menos de una hora, aunque generalmente presentan menor sensibilidad que los métodos basados en cultivos.

La utilización de secuencias polinucleótidas específicas como sondas para el reconocimiento de agentes infecciosos es una alternativa a los problemáticos ensayos de identificación inmunológica y otras metodologías preexistentes. Por ejemplo, las sondas de ácidos nucleicos complementarias a secuencias de ácidos nucleicos diana se han utilizado en procedimientos de hibridación, tales como las transferencias southern y las transferencias por puntos, con el fin de detectar la secuencia de ácidos nucleicos diana. Muchos de dichos procedimientos de hibridación han dependido del cultivo y/o enriquecimiento del organismo y, de esta manera, resultan inadecuados para el diagnóstico rápido. La aparición de técnicas para la amplificación rápida de secuencias específicas de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa entre muchas otras, han proporcionado un mecanismo para utilizar sondas específicas de secuencia directamente en especímenes clínicos, eliminando de esta manera el enriquecimiento y cultivo in vitro del patógeno previamente a la realización del ensayo de hibridación. De esta manera, los ensayos de hibridación basados en la amplificación pueden proporcionar técnicas diagnósticas simples y rápidas para la detección de patógenos en muestras clínicas.

Muchas de las sondas utilizadas hasta hoy no presentan suficiente especificidad para diferenciar entre agentes patogénicos que presentan secuencias de ácidos nucleicos altamente homólogas, tales como N. gonorrhoeae, N. meningitidis y similares. Esto ha conducido a resultados de ensayo sesgados, incluyendo resultados falsos positivos. Una consecuencia de dicho diagnóstico erróneo podría ser la administración de un curso de tratamiento inapropiado para el paciente.

El documento WO nº 02/079423 da a conocer un número elevado de secuencias que se expresan en Neisseria gonorrhoeae y que no presentan homología con secuencia de otras bases de datos. En particular, las SEC ID nº 33 y nº 51 del documento WO nº 02/079423 se solapan con SEC ID nº 1 de la presente solicitud y SEC ID nº 121 y nº 125 se solapan con SEC ID nº 2.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos y reactivos para la detección rápida de Neisseria gonorrhoeae que son específicos de especie, es decir, sin detección sustancial de otras especies en el género Neisseria o de otras especies de otros géneros. Por ejemplo, los reactivos de detección de ácidos nucleicos de la invención (por ejemplo sondas de ácidos nucleicos, anticuerpos específicos de secuencia, etc.) típicamente se unen a secuencias de nucleótidos presentes en N. gonorrhoeae pero no en otras especies. Además, debido a que los pacientes infectados por N. gonorrhoeae con frecuencia también resultan infectados por Chlamydia trachomatis, la invención proporciona además métodos para detectar concurrentemente N. gonorrhoeae y C. trachomatis en muestras. Este enfoque minimiza el número de procedimientos diagnósticos a los que se somete un paciente, lo que típicamente también minimiza el coste total del diagnóstico. Además de las composiciones y mezclas de reacción, la invención se refiere además a kits y sistemas para detectar dichos agentes patogénicos, y a medios informáticos y medios legibles por ordenador relacionados.

En un aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido según las reivindicaciones que consiste de un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 ó complementos de las mismas. En otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que comprende un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 y complementos de las mismas, presentando dicho oligonucleótido 100 ó menos nucleótidos. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un oligonucleótido que incluye un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% (por ejemplo de por lo menos 95%, etc.) respecto a una de SEC ID nº 3 a nº 27 ó un complemento de las mismas, presentando dicho oligonucleótido 100 ó menos nucleótidos. Típicamente, dichos oligonucleótidos son cebadores de ácidos nucleicos, sondas de ácidos nucleicos o similares en dichas realizaciones. En algunas de dichas realizaciones, los oligonucleótidos presentan 40 ó menos nucleótidos (por ejemplo 35 ó menos nucleótidos, 30 ó menos nucleótidos, etc.) . En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden por lo menos un nucleótido modificado. Opcionalmente, los oligonucleótidos comprenden por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción inhibidora. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos incluyen por lo menos una variación modificada conservadoramente.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de detección de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, según se definen en las reivindicaciones 8 a 17.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra según las reivindicaciones 18 y 19. En la presente invención, el seguimiento se lleva a cabo, por ejemplo, en un sólo tiempo, en múltiples tiempos discretos, continuamente durante un periodo de tiempo seleccionado, etc. En algunas realizaciones, por ejemplo, los ácidos nucleicos y/o los amplicones de los mismos comprenden por lo menos una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 28 a nº 33. En determinadas... [Seguir leyendo]

1. Oligonucleótido capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico que presenta SEC ID nº 1 ó nº 2 que comprende un ácido nucleico que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90%, preferentemente una identidad de secuencia de por lo menos 95% respecto a una de SEC ID nº 3 a nº 27 ó un complemento de las mismas a lo largo de la longitud completa de SEC ID nº 3 a nº 27 ó el complemento de las mismas, presentando dicho oligonucleótido 100 ó menos nucleótidos.

2. Oligonucleótido según la reivindicación 1, que comprende un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 y complementos de las mismas, presentando dicho oligonucleótido 100 ó menos nucleótidos.

3. Oligonucleótido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido comprende una sonda de ácidos nucleicos

o un cebador de ácidos nucleicos.

4. Oligonucleótido según la reivindicación 1 ó 2, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos un nucleótido modificado.

5. Oligonucleótido según la reivindicación 1 ó 2, en el que el oligonucleótido comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción inhibidora.

6. Oligonucleótido según la reivindicación 1 ó 2, en el que el oligonucleótido presenta 40 ó menos nucleótidos.

7. Oligonucleótido según la reivindicación 2, en el que el oligonucleótido de un ácido nucleico con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 y complementos de las mismas.

8. Método de detección de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una primera pareja de cebadores de ácidos nucleicos que comprende por lo menos un ácido nucleico seleccionado de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 y una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en las que el variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a las SEC ID nº 3 a nº 27 a lo largo de la longitud completa de SEC ID nº 3 a nº 27 o a uno de los complementos de SEC ID nº 3 a nº 27, en por lo menos una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, y

(b) detectar los ácidos nucleicos y/o uno o más amplicones de los mismos de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a) , detectando de esta manera Neisseria gonorrhoeae en la muestra.

9. Método según la reivindicación 8, en el que los ácidos nucleicos y/o los amplicones de los mismos comprenden por lo menos una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 28 a nº 33.

10. Método según la reivindicación 8, en el que (a) comprende poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra con por lo menos una segunda pareja de cebadores de ácidos nucleicos que son por lo menos parcialmente complementarios a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis, y (b) comprende detectar uno o más amplicones adicionales de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos durante o después de (a) , detectando de esta manera Chlamydia trachomatis en la muestra.

11. Método según la reivindicación 8, en el que por lo menos uno de los cebadores de ácidos nucleicos comprende un cebador de ácidos nucleicos modificado.

12. Método según la reivindicación 8, en el que por lo menos uno de los cebadores de ácidos nucleicos comprende por lo menos un marcaje.

13. Método según la reivindicación 12, en el que (b) comprende detectar una señal detectable producida por el marcaje, o amplificar una señal detectable producida por el marcaje para producir una señal amplificada y detectar la señal amplificada.

14. Método según la reivindicación 8, en el que (b) comprende realizar un seguimiento de la unión entre los amplicones y uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico con una secuencia que consiste de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en las que la variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a las SEC ID nº 1 ó 2, o un complemento de SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, o la variante.

15. Método según la reivindicación 14, en el que por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un ácido nucleico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 y una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en las que el variante presenta una identidad de

secuencia de por lo menos 90% respecto a las SEC ID nº 3 a nº 27 a lo largo de la longitud completa de SEC ID nº 3 a nº 27 o a uno de los complementos de SEC ID nº 3 a nº 27.

16. Método según la reivindicación 14, en el que por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende un oligonucleótido.

17. Método según la reivindicación 14, en el que por lo menos uno de los reactivos de detección de ácidos nucleicos comprende por lo menos un marcaje y/o por lo menos una fracción inhibidora.

18. Método para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos de la muestra con por lo menos un oligonucleótido que presenta 100 ó menos nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 y una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en las que el variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a las SEC ID nº 3 a nº 27 a lo largo de la longitud completa de SEC ID nº 3 a nº 27 ó a uno de los complementos de SEC ID nº 3 a nº 27, y

(b) realizar un seguimiento de la unión entre los ácidos nucleicos y/o los amplicones de los mismos, y el oligonucleótido, en el que la unión detectable entre los ácidos nucleicos y/o los amplicones de los mismos, y el oligonucleótido, determina la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra.

19. Método según la reivindicación 18, en el que la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no ha sido demostrada antes de (a) .

20. Kit para detectar Neisseria gonorrhoeae en una muestra, que comprende:

(a) por lo menos un oligonucleótido que presenta 100 ó menos nucleótidos, comprendiendo el oligonucleótido una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de: SEC ID nº 3 a nº 27 y una variante sustancialmente idéntica de las mismas, en las que el variante presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a las SEC ID nº 3 a nº 27 a lo largo de la longitud completa de SEC ID nº 3 a nº 27 o a uno de los complementos de SEC ID nº 3 a nº 27, y uno o más de:

(b) instrucciones para determinar la presencia de Neisseria gonorrhoeae en una muestra mediante el seguimiento de la unión entre ácidos nucleicos y/o amplicones de los mismos de la muestra y el oligonucleótido, en las que la presencia de Neisseria gonorrhoeae en la muestra es desconocida o no ha sido demostrada, o

(c) por lo menos un recipiente para empaquetar por lo menos el oligonucleótido.

21. Kit según la reivindicación 20, que comprende además uno o más reactivos de detección de ácidos nucleicos que se unen detectablemente a un ácido nucleico de Chlamydia trachomatis.

22. Kit según la reivindicación 20, que comprende además por lo menos un enzima.