Nuevo gen de la lisina descarboxilasa y procedimiento para la producción de L-lisina.

LA L - LISINA SE PRODUCE CON EFICIENCIA CULTIVANDO, EN UN MEDIO LIQUIDO,

UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO ESCHERICHIA CON ACTIVIDAD LISINA DESCARBOXILASA REDUCIDA O SUPRIMIDA NECESARIA PARA LA DEGRADACION DE LA L - LISINA, POR EJEMPLO, UNA BACTERIA PERTENECIENTE AL GENERO ESCHERICHIA CON EXPRESION INHIBIDA DE UN NUEVO GEN QUE CODIFICA LA LISINA DESCARBOXILASA Y/O UN GEN CONOCIDO CADA, CONSIGUIENDO ASI QUE LA L - LISINA SE PRODUZCA Y ACUMULE EN UN MEDIO LIQUIDO PARA LUEGO RECOGERLA.

Nuevo gen de la lisina descarboxilasa y procedimiento para la producción de L-lisina.

Campo tecnico La presente invención se refiere a un nuevo gen de la lisina descarboxilasa de Escherichia Coli, apropiado para la descomposición de la L-lisina, un microorganismo que pertenece al género Escherichia con una expresión moderada del gen y/o otro gen de la lisina descarboxilasa conocido como gen cadA, y un procedimiento para la producción de L-lisina utilizando el microorganismo. Recientemente, aumenta activamente la demanda de L-lisina como aditivo alimentario.

Antecedentes de la invencion La lisina descarboxilasa, que cataliza una reacción para la producción de cadaverina mediante la descarboxilación de la L-lisina, se conoce como una enzima de Escherichia Coli que descompone la L-lisina. Se ha informado ya de una secuencia nucleótida de su gen denominado cadA, y de una secuencia de aminoácidos codificada por el gen (Meng, S. y Bennett, G. N., J. Bacteriol., 174 , 2659 (1992) ) . Existen dos informes para la lisina descarboxilasa codificada por un gen distinto que el cadA de Escherichia Coli, que describen que se detectó una tenue actividad en una cepa mutante de Escherichia Coli (Goldemberg, S.H., J. Bacteriol., 141, 1428 (1980) ; Wertheimer, S.J. y Leifer, Z., Biochem. Biophys. Res. Commun., 114, 882 (1983) ) . Sin embargo, Goldemberg, S.H. informó respecto a esta actividad que la actividad enzimática disminuía en una cuantía de aproximadamente 30% después de un tratamiento con calor a 60ºC durante 4 minutos, mientras que Wertheimer, S.J. et al informaron de que no se había observado dicho fenómeno. De acuerdo con esto, la presencia de la segunda lisina descarboxilasa es indeterminada.

Por otra parte, la L-lisina es producida mediante procedimientos conocidos que utilizan Escherichia Coli, que incluyen un procedimiento que comprende el cultivo de una cepa mutante resistente a un análogo de la lisina o de una cepa recombinante que alberga un vector con ácido desoxirribonucleico incorporado que transporta información genética importante para la biosíntesis de la L-lisina (Patente Japonesa abierta al público nº 56-18596) . Sin embargo, no existen informes en absoluto respecto a la producción de la L-lisina utilizando un microorganismo que pertenezca al género Escherichia con una expresión moderada del gen de la lisina descarboxilasa.

B. Lereverend et al., Proc. Int. Symp. Genet. Ind. Microorgan isms, 4 Meet., 1982, página 113, da a conocer un mutante de Escherichia Coli superproductor de lisina que transporta una mutación cadA que afecta a la actividad lisina-descarboxilasa, disminuyendo, por tanto, el catabolismo de la lisina.

K. Igarashi et al., J. Bacteriol., vol. 166, nº 1, . 1986, páginas 128-124, da a conocer la presencia de dos tipos de actividad lisina descarboxilasa en E. Coli. Una es la lisina descarboxilasa inducible habitual y la otra es la ornitina descarboxilasa codificada por el gen speC.

Exposicion de la invencion Un objetivo de la presente invención es obtener un nuevo gen de la lisina descarboxilasa de Escherichia Coli, crear un microorganismo productor de L-lisina que pertenezca al género Escherichia con una expresión moderada del gen y/o el gen cadA, y proporcionar un procedimiento para la producción de L-lisina cultivando el microorganismo que pertenezca al género Escherichia.

Los objetivos de la presente invención son resueltos por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando estos inventores crearon una cepa de Escherichia Coli en la que se destruyó el gen cadA como un conocido gen de la lisina descarboxilasa, se descubrió que la cadaverina, como producto de descomposición de la L-lisina por la lisina descarboxilasa, se producía todavía en esta cepa microbiana. Por tanto, estos inventores convinieron que en Escherichia Coli debía estar presente una nueva lisina descarboxilasa, y que podría afectar en gran manera la producción fermentativa de L-lisina, utilizando un microorganismo que perteneciera al género Escherichia. Como resultado de ensayos para obtener la clonación del gen, estos inventores alcanzaron el éxito en la obtención de un nuevo gen de la lisina descarboxilasa distinto del gen cadA. Se descubrió asimismo que la actividad de descomposición de la L-lisina disminuyó notablemente o desapareció, y la productividad de la L-lisina mejoró significativamente restringiendo la expresión de este gen, y restringiendo la expresión del gen cadA en un microorganismo de Escherichia Coli productor de L-lisina. De este modo, se concluyó la presente invención.

Concretamente, la presente invención proporciona un nuevo gen que codifica la lisina descarboxilasa que se origina de Escherichia Coli. Este gen se ha denominado gen "ldc".

En otro aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo que pertenece al género Escherichia que produce L-lisina con una disminución o desaparición de la actividad lisina descarboxilasa en las células.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de L-lisina, que comprende las etapas de cultivar en un medio líquido el microorganismo que pertenece al género Escherichia que se ha descrito anteriormente, para permitir que se produzca la L-lisina y se acumule en un líquido de cultivo, pudiéndola recuperar.

El microorganismo que pertenece al género Escherichia que se ha descrito anteriormente incluye un microorganismo en el que la actividad de la lisina descarboxilasa en las células disminuye o desaparece por la expresión moderada (o restringida) del gen ldc y/o del gen cadA.

La presente invención se describirá detalladamente a continuación.

<1> Preparación del fragmento de ADN que contiene el nuevo gen de la lisina descarboxilasa Un fragmento de ADN que contiene el nuevo gen de la lisina descarboxilasa (ldc) de la presente invención puede obtenerse de la manera siguiente, a partir de una cepa disponible de Escherichia Coli, por ejemplo, la cepa K-12 o de una cepa derivada de ella.

En primer lugar, el gen cadA, que es un gen conocido de la lisina descarboxilasa, se obtiene a partir del ADN cromosómico de la cepa W3110 que se origina de Escherichia Coli K-12 utilizando el método de la reacción en cadena de la polimerasa (al que en adelante se denominará "método PCR") . La secuencia nucleótida del gen cadA, y la secuencia de aminoácidos codificada por él, se muestran en SEC ID nº 5 y nº 6, respectivamente. Fragmentos de ADN que tienen secuencias similares al gen cadA son clonados a partir de una biblioteca de ADN cromosómico de Escherichia Coli W3110 según un procedimiento que utiliza un vector plasmídico o un vector fágico para confirmar si el nuevo gen de la lisina descarboxilasa está o no contenido en los fragmentos del ADN. La confirmación del hecho de que el gen objetivo está contenido, puede obtenerse según un procedimiento de hibridización Southern, utilizando una sonda preparada mediante el método PCR.

Del gen contenido en el fragmento de ADN, gen que se ha obtenido de esta forma, se determina su secuencia nucleótida de la siguiente manera. En primer lugar, el fragmento de ADN se une a un vector plasmídico que se replica autónomamente en células de Escherichia Coli, para preparar ADN recombinante que se introduce en células competentes de Escherichia Coli. Después de la obtención de un transformante, se cultiva en un medio líquido, recuperándose el ADN recombinante a partir de las células que proliferaron. De acuerdo con el procedimiento didesoxi (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 74 , 5463 (1977) , se determina una secuencia nucleótida entera del fragmento de ADN contenido en el ADN recombinante recuperado. Se analiza la estructura del ADN para determinar las posiciones que existen del promotor, operador, secuencia SD, codón de iniciación, codón de finalización, marco abierto de lectura, etc.

El nuevo gen de la lisina descarboxilasa de la presente invención posee una secuencia de 1005-1007 ATG a 31413143 GGA de la secuencia nucleótida entera del fragmento de ADN que se muestra en SEC ID nº: 3 en el listado de secuencias. Este gen codifica la lisina descarboxilasa que posee una secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4 en el Listado de Secuencias. Se ha descubierto que la homología entre la nueva lisina descarboxilasa y la lisina descarboxilasa codificada por el gen cadA es del 69, 4%.

El gen de la presente invención puede ser aquél que codifica la lisina descarboxilasa que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias, una secuencia nucleótida de la cual no está limitada a la secuencia nucleótida que se ha descrito anteriormente. La lisina descarboxilasa codificada por el... [Seguir leyendo]

1. Gen que codifica la lisina descarboxilasa que posee una secuencia de aminoácidos que se define en los apartados (A) o (B) siguientes:

(A) una secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4,

(B) una secuencia de aminoácidos que presenta sustitución, deleción o inserción de 3 residuos aminoácidos o menos en la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 4 en el listado de secuencias sin ningún deterioro sustancial de la actividad lisina descarboxilasa.

2. Gen según la reivindicación 1, en el que el gen posee una secuencia nucleótida desde el nucleótido 1005º al 3143º representada en SEC ID nº: 3.

3. Fragmento de ADN que contiene un gen según la reivindicación 1 ó 2.

4. Procedimiento para que disminuya o desaparezca la actividad de la lisina descarboxilasa codificada por el gen según la reivindicación 1 ó 2, en el que el gen según la reivindicación 1 ó 2 se modifica por sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o de una pluralidad de nucleótidos en una secuencia nucleótida en el gen.

5. Microorganismo que pertenece al género Escherichia, en el que el gen según la reivindicación 1 ó 2, una secuencia promotora del gen o una región entre una secuencia SD y un codón de iniciación del gen, es modificada por sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o una pluralidad de nucleótidos en la secuencia nucleótida del gen, la secuencia promotora o la región entre una secuencia SD y un codón de iniciación, por lo que disminuye o desaparece en las células la actividad de una lisina descarboxilasa codificada por el gen.

6. Microorganismo según la reivindicación 5, en la que dicho microorganismo es Escherichia Coli.

7. Microorganismo según la reivindicación 5 ó 6, en el que el gen cadA que codifica la lisina descarboxilasa que posee la secuencia de aminoácidos representada en SEC ID nº: 6, una secuencia promotora del gen cadA o una región entre una secuencia SD y un codón de iniciación del gen cadA, son modificados por sustitución, deleción, inserción, adición o inversión de uno o una pluralidad de nucleótidos en la secuencia nucleótida del gen cadA, la secuencia promotora del gen cadA o la región entre una secuencia SD y un codón de iniciación del gen cadA, por lo que disminuye o desaparece adicionalmente la actividad de una lisina descarboxilasa codificada por el gen cadA.

8. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 7, que pertenece al género Escherichia y presenta la capacidad de producir L-lisina.

9. Procedimiento para la producción de L-lisina, que comprende la etapa de cultivo de un microorganismo según la reivindicación 8 en un medio líquido.