Nuevas moléculas moduladoras para un sistema de expresión regulado mejorado.

Un sistema de expresión regulado que comprende al menos un vector y una molécula activadora (MA),

comprendiendo dicho vector:

un primer casete de expresión que comprende: i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica unamolécula terapéutica (MT) que tiene una actividad terapéutica y ii) un primer promotor y un primer sitio poli(A)unido operativamente a dicha primera secuencia de ácido nucleico, en el que dicha MT puede expresarse encélulas de un sujeto, y dicha expresión o actividad de MT es dependiente de la dosis y está regulada o inducidaen presencia de una molécula reguladora (MR); y un segundo casete de expresión que comprende: i) unasegunda secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula reguladora (RIv)7 y ii) un segundo promotor yun segundo sitio poli(A) unido operativamente a dicha segunda secuencia de ácido nucleico, en el que dicha MRpuede expresarse en dichas células y activarse en presencia de una molécula activadora (MA), regulando deesta manera dicha expresión o actividad de MT, y en el que dicha MA es un modulador de receptor de esteroidemodificado que es una mifepristona modificada (MFP), en el que dicha mifepristona modificada es un anillosustituido 11-beta seleccionado del grupo que consiste en BLX-913, BLX-899, BLX-952, BLX-61 0, BLX-117 yBLX-784 y tiene un efecto escaso o limitado sobre hPR humano.

Nuevas moléculas moduladoras para un sistema de expresión regulado mejorado Campo de la invención La presente invención se refiere a un sistema de expresión mejorado para la expresión regulada de una molécula terapéutica (MT) de proteína o ácido nucleico codificada, para su uso en el tratamiento de enfermedades. En particular, la presente invención se refiere a nuevas moléculas moduladoras para dichos sistemas de expresión génicos regulados mejorados y a composiciones farmacéuticas y a usos de las mismas para el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes de la invención Se piensa que la administración de ácidos nucleicos que codifican moléculas terapéuticas (MT) para el tratamiento de enfermedades proporciona un enorme potencial como una modalidad terapéutica sobre los procedimientos de tratamiento convencionales. En particular, la administración de ácidos nucleicos que codifican una proteína terapéutica en terapia génica tiene la posibilidad de proporcionar ventajas significativas sobre terapias convencionales que requieren la administración de proteínas en embolada Estas posibles ventajas incluyen, por ejemplo, la expresión prolongada y regulada de una MT en las células de un paciente dando como resultado una eficacia terapéutica máxima y efectos secundarios mínimos y también, la evitación de toxicidad e impurezas infecciosas y de impurezas sistémicas.

Por ejemplo, se sabe que la administración de proteínas en embolada para el tratamiento de enfermedades da como resultado efectos secundarios adversos incluyendo, por ejemplo, los relacionados con impurezas infecciosas y tóxicas, toxicidad sistémica, necrosis en el sitio de inyección, síntomas de tipo gripales, escalofríos, fiebre, fatiga, anorexia, y pérdida de peso. En algunos casos estos sucesos son limitadores de dosis y pueden conducir al cese del tratamiento en su conjunto. Además, se sabe que la exposición continua a algunas sustancias terapéuticas proteicas puede dar como resultado tolerancia a lo largo del tiempo. Por tanto, existe necesidad de un sistema de expresión regulado que pueda proporcionar un nivel prolongado o a largo plazo terapéuticamente eficaz de una MT con la característica adicional de un medio para reducir rápidamente o modular el nivel de MT dentro de una ventana terapéutica dinámica. Más particularmente, existe una necesidad de un sistema de expresión regulado que tenga la capacidad de desactivarse si la concentración de MT alcanzara un nivel que sea posiblemente tóxico. Adicionalmente, la capacidad de titular el nivel de MT permitiría dosificar para ajustar cuando existe una posibilidad de aumentar la tolerancia hacia la MT a lo largo del tiempo.

De particular interés y necesario es el suministro de un gen que codifique una proteína terapéutica que pueda expresarse en células diana de pacientes para remediar una afección resultante o producida por una enfermedad o detener o reducir la progresión de una enfermedad. Por ejemplo, las etiologías de muchas patologías son el resultado de la expresión de uno o más productos génicos defectuosos o el sistema defectuoso de uno o más productos génicos, por ejemplo, la expresión de una proteína mutada o la sobre o infra expresión de una proteína, respectivamente. Por lo tanto, los procedimientos de tratamiento convencionales incluyen la administración de proteínas recombinantes que corrijan dicha expresión de proteína defectiva o expresión de una proteína defectiva. Sin embargo, se sabe que la administración de agentes terapéuticos proteicos a un paciente da como resultado la generación de anticuerpos contra la proteína y su rechazo por el sistema inmunitario del paciente como extraño.

Por tanto, existe necesidad de una administración basada en genes de proteínas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades que proporcione la expresión regulada prolongada de la proteína, dando como resultado la eficacia terapéutica al mismo tiempo que minimiza los efectos secundarios tóxicos limitantes de la dosis. Dicho sistema de expresión regulado impediría muchos de los principales factores limitantes asociados con los agentes terapéuticos proteicos actuales. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de administración de ácidos nucleicos conocidos no son adecuados para el uso clínico y no consiguen una expresión regulada o prolongada en las células. Se ha descrito que únicamente unos pocos sistemas de administración de ácidos nucleicos conocidos tienen una capacidad de regular la expresión transgénica en condiciones de laboratorio pero la idoneidad y viabilidad de estos sistemas de administración para el uso clínico se desconocen (véase por ejemplo, Gossen, M. & Bujard H. (1995) Science 268: 1766-69; No, D. y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-51; Amara, J.F. y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10618-23; Wang, Y. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8180-84; Nordstrom, J. L. (2002) Curr. Opin. Biotechnol.13: 453-58) .

Sumario de la invención La presente divulgación proporciona un sistema de expresión mejorado para la expresión regulada de una proteína terapéutica o molécula terapéutica (MT) de ácido nucleico para su uso en el tratamiento de enfermedades, en el que la eficacia terapéutica de la MT puede maximizarse y los efectos secundarios minimizarse. En particular, la presente divulgación proporciona nuevas moléculas moduladoras, por ejemplo, nuevas moléculas activadoras (MA) moléculas inactivadoras (MI) y moléculas reguladoras (MR) para dicho sistema de expresión génico regulado mejorado y composiciones farmacéuticas y procedimientos de los mismos para el tratamiento de enfermedades.

En particular, la presente divulgación proporciona MA o MI que se unen selectivamente a una MR que tiene modificaciones que potencian esta selectividad. Por lo tanto, las nuevas MA y MI de la presente invención presentan propiedades mejoradas que se unen selectivamente o de otra manera interaccionan con una nueva MR de la presente invención, y disminuye o elimina la reactividad cruzada con proteínas endógenas, particularmente proteínas humanas endógenas, por ejemplo, un receptor, más particularmente un receptor de esteroides, e incluso más particularmente una RP o RG. En algunos aspectos, una nueva MA o MI de la presente divulgación un modulador de MR, particularmente un modulador receptor modificado, más particularmente un modulador de receptores de esteroides modificados, incluso más particularmente un modulador de RP o RG, por ejemplo un análogo del ligando de RP o RG.

En un aspecto, la MA o MI de la presente divulgación es un análogo de ligando de RP que se une selectivamente a una MR que tiene una LBD modificada o más particularmente una LBP modificada, y tiene efectos secundarios disminuidos o ninguno en relación con por ejemplo, reactividad cruzada con un RP endógeno y otros receptores de esteroides endógenos, la actividad abortiva, o actividad anticonceptiva.

Más particularmente, la presente divulgación proporciona nuevas MA, MI y MR que tienen propiedades mejoradas, incluyendo la capacidad de regular estrecha y específicamente el nivel de expresión de MT, de tal manera que la expresión de la MT puede modularse por ejemplo para aumentar o disminuir o activar y desactivar, MT. Cabe destacar, que las MA y MI de la presente divulgación tienen una selectividad mejorada para una MR de la presente divulgación. En algunos aspectos, la LBD y más particularmente la LBP de la MR se modifica para unirse a la MA o MI y/o es sensible a la MA o MI respectivamente, con una especificidad y selectividad mejoradas.

Por ejemplo, una MA de la presente divulgación puede ser, pero sin limitación, una MA que se una selectivamente a y/o active una MR, y tenga un escaso efecto o ninguno sobre una proteína endógena, por ejemplo, un receptor de esteroides endógeno. Además, por ejemplo, la MR de la presente invención puede ser, pero sin limitación, una MR que está modificada para unirse específicamente y/o de otra manera interaccionar con una MA y por lo tanto está activada por la MA. En algún aspecto, la MA se une o de otra manera interacciona con la MR y activa selectivamente la MR, de tal manera que la MR activada aumenta o activa la expresión de la MT. Por lo tanto, una MA y/o MR de la presente divulgación, proporciona la capacidad de regular estrecha y específicamente el nivel de la expresión y/o actividad de la MT. En algunos aspectos, la MA se une a una sola MR modificada para unirse selectivamente a la MA.

En algunos aspectos, una MI de la presente divulgación puede ser, pero sin limitación, una MI que se une selectivamente a y/o inactiva una MR, y tiene escaso o ningún efecto sobre una proteína endógena, por ejemplo, un receptor de esteroide endógeno. Además,... [Seguir leyendo]

1. Un sistema de expresión regulado que comprende al menos un vector y una molécula activadora (MA) , comprendiendo dicho vector:

un primer casete de expresión que comprende: i) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula terapéutica (MT) que tiene una actividad terapéutica y ii) un primer promotor y un primer sitio poli (A) unido operativamente a dicha primera secuencia de ácido nucleico, en el que dicha MT puede expresarse en células de un sujeto, y dicha expresión o actividad de MT es dependiente de la dosis y está regulada o inducida en presencia de una molécula reguladora (MR) ; y un segundo casete de expresión que comprende: i) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica dicha molécula reguladora (RIv) 7 y ii) un segundo promotor y

un segundo sitio poli (A) unido operativamente a dicha segunda secuencia de ácido nucleico, en el que dicha MR puede expresarse en dichas células y activarse en presencia de una molécula activadora (MA) , regulando de esta manera dicha expresión o actividad de MT, y en el que dicha MA es un modulador de receptor de esteroide modificado que es una mifepristona modificada (MFP) , en el que dicha mifepristona modificada es un anillo sustituido 11-beta seleccionado del grupo que consiste en BLX-913, BLX-899, BLX-952, BLX-61 0, BLX-117 y

BLX-784 y tiene un efecto escaso o limitado sobre hPR humano.

2. El sistema de expresión regulado de la reivindicación 1, en el que dicho vector puede administrarse poniendo en contacto dichas células con dicho vector in vivo o ex vivo.

3. Una composición farmacéutica que comprende al menos un sistema de expresión de acuerdo con la reivindicación 1.

4. Un kit para administrar una molécula terapéutica (MT) a las células de un sujeto, comprendiendo dicho kit al menos un sistema de expresión regulado de acuerdo con la reivindicación 1 e instrucciones para su uso.

Figura 42. Inhibición de la actividad del receptor de progesterona por los ocho compuestos de clase 3 identificados a partir de la exploración dirigida. Se sembraron células T47D humanas ricas en RP en placas de 96 pocillos y se permitió su unión durante una noche. El medio de crecimiento que contenía FBS al 10 % se cambió por medio de ensayo que contenía medio sin fenol y FBS tratado con carbón vegetal al 3 %. Al siguiente día, las células se trataron con MFP o con los compuestos de ensayo a concentraciones de 0, 1, 1 y 10 nM durante 24 horas en presencia de Promegestona (PMG) 200 pM, un agonista de RP que estimula la expresión de la Fosfatasa Alcalina (AP) mediante la ruta RP en células T47D. La actividad de la AP en lisados de células tratadas se midió mediante su capacidad para hidrolizar el para-Nitrofenil Fosfato en un ensayo cromogénico. Las antiprogestinas compiten con PMG para la unión con el RP e inhiben la expresión de la AP en células T47D. El grado de esta inhibición se presenta como la inhibición porcentual con compuestos más potentes (tales como MFP) capaces de inhibir al 100 % la expresión de la AP dependiente del RP.

Figura 44 Inhibición de la actividad de la Fosfatasa Alcalina (AP) inducida por RP por la potente antiprogestina Mifepristona (MFP) y el nuevo compuesto candidato de Molécula Activadora BLX-913. Se sembraron células T47D humanas ricas en RP en placas de 96 pocillos y se permitió su unión durante una noche. El medio de cultivo que contenía FBS al 10 % se cambió por medio de ensayo que contenía medio sin fenol y FBS tratado con carbón vegetal al 3 %. Al día siguiente, las células se trataron con MFP o BLX-913 durante 24 horas en presencia de Promegestona (PMG) 200 pM, un agonista de RP que estimula la expresión de la Fosfatasa Alcalina (AP) mediante la ruta RP en células T47D. La actividad de la AP en lisados de células tratadas se mide mediante su capacidad para hidrolizar el para-Nitrofenil Fosfato en un ensayo cromogénico. Las antiprogestinas compiten con PMG por la unión a RP e inhiben la expresión de la AP en células T47D, dando como resultado una tasa disminuida de la actividad de la AP a mayores concentraciones de antiprogestina.

Figura 46. Imagen estéreo del modelo predicho de BLX-913 unido en el LBP del LBD de la MR. Los conflictos entre el sustituyente 11∀-benzaldoxima de BLX-913 y la cadena lateral del Triptófano 755 de la MR se muestran con líneas discontinuas.

Figura 47 Activación mejorada de la MR mutante W755A mediante BLX-913 en comparación con la de la proteína MR original. Se transfectaron temporalmente Células Renales Embrionarias Humanas (HEK 293) con plásmidos pBRES-Luc que portaban mutaciones en la posición 719 o 755 junto con la construcción wt-pBRES (pGT79) . Veinticuatro horas después de la transfección, las células se volvieron a sembrar en placas de 96 pocillos y al día siguiente se trataron con el compuesto BLX-913 a concentraciones de 1, 10 y 100 nM. Después de las 24 horas de tratamiento se determinó el grado de activación de MR midiendo la cantidad de indicador luciferasa expresado.

Figura 48 Activación mejorada de la MR mutante V729L/W755A mediante BLX-913 en comparación con la de la proteína MR original. Se transfectaron temporalmente Células Renales Embrionarias Humanas (HEK 293) con plásmidos pBRES-Luc que portaban mutaciones en la posición 729 y/o 755 junto con la construcción wt-pBRES (pGT79) . Veinticuatro horas después de la transfección, las células volvieron a sembrarse en placas de 96 pocillos y al día siguiente se trataron con el compuesto BLX-913 a concentraciones de 1, 10 y 100 nM. Después de 24 horas de tratamiento se determinó el grado de activación de MR midiendo la cantidad de indicador luciferasa expresado.

Figura 49 Respuesta a la dosis de mutantes de MR con respecto a BLX-913. Se transfectaron temporalmente Células Renales Embrionarias Humanas (HEK 293) con plásmidos pBRES-Luc que portaban mutaciones en la posición 729 y/o 755 junto con la construcción wt-pBRES (pGT79) . Veinticuatro horas después de la transfección, las células volvieron a sembrarse en placas de 96 pocillos y al siguiente día se trataron con el compuesto BLX-913 a concentraciones de hasta 1 #M. Después de 24 horas de tratamiento se determinó el grado de activación de MR midiendo la cantidad del indicador luciferasa expresado.

Figura 50. Efecto de mutaciones de LBD sobre el nivel de proteína MR. Se muestra el nivel de proteína MR expresado a partir de construcciones pBRES de tipo silvestre (pGT79) (Carril 1) , W755A (pGT1009) (Carril 2) y V729L/W755A (pGT1017) (Carril 3) en células HEK 293. Se resolvieron las mismas cantidades de lisados celulares que expresaban cada una de las proteínas MR en SDS-PAGE al 10 % y se visualizaron sobre la transferencia de Western usando el anticuerpo anti-NF-∃B p65 de conejo (1:200, Santa Cruz, sc-372) , que reconoce la proteína p65 endógena (65 kDa) en las células HEK 293 y la proteína MR (70 kDa) .

Figura 52 Inhibición de la actividad del receptor de Progesterona por los cuatro análogos de MFP con modificaciones en las posiciones 15 y 16. Se sembraron células T47D humanas ricas en RP en placas de 96 pocillos y se permitió su unión durante una noche. El medio de crecimiento que contenía FBS al 10 % se cambió por medio de ensayo que contenía medio sin fenol y FBS tratado con carbón vegetal al 3 %. Al día siguiente, las células se trataron con MFP o con compuestos de ensayo a concentraciones de 0, 1, 1 y 5 nM durante 24 horas en presencia de Promegestona (PMG) 200 pM, una agonista de RP que estimula la expresión de la Fosfatasa Alcalina (AP) mediante la ruta RP en células T47D. La actividad de la AP en lisados de células tratadas se midió mediante su capacidad para hidrolizar el para-Nitrofenil Fosfato en un ensayo cromogénico. Las antiprogestinas compiten con PMG para unirse a RP e inhiben la expresión de AP en células T47D. El grado de esta inhibición se presenta como un porcentaje de inhibición con compuestos más potentes (tales como MFP) capaces de inhibir al 100 % la expresión de la AP dependiente del RP.

Figura 54. Inhibición de la actividad del receptor de Progesterona por análogos con modificaciones en las posiciones 4 y 7. Se sembraron células T47D humanas ricas en RP en placas de 96 pocillos y se dejaron unirse durante una noche. El medio de crecimiento que contenía FBS al 10 % se cambió por medio de ensayo que contenía medio sin fenol y FBS tratado con carbón vegetal al 3 %. Al día siguiente, las células se trataron con MFP o con compuestos de ensayo a concentraciones de 1, 10 y 100 nM durante 24 horas en presencia de Promegestona (PMG) 200 pM, un agonista de RP que estimula la expresión de la Fosfatasa Alcalina (AP) mediante la ruta RP en células T47D. La actividad de la AP en lisados de células tratadas se midió mediante la capacidad de hidrolizar el para-Nitrofenil Fosfato en un ensayo cromogénico. Las antiprogestinas compiten con PMG para unirse al RP e inhiben la expresión de la AP en células T47D. El grado de esta inhibición se presenta como porcentaje de inhibición con compuestos más potentes (tales como MFP) capaces de inhibir al 100 % la expresión de la AP dependiente del RP.