Molécula vehículo recombinante para la expresión, el suministro y la purificación de polipéptidos diana.

Una proteína vehículo que comprende:

(a) un polipéptido de liquenasa B que consiste en un polipéptido con al menos un 80 % de identidad desecuencia con un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los aminoácidos 14-231 de lasecuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 E y los aminoácidos 8-226 de la secuencia de aminoácidosmostrada en la Figura 1 H;

opcionalmente fusionado a

(b) una secuencia polipeptídica heteróloga que no se halla en el polipéptido de liquenasa B.

Molécula vehículo recombinante para la expresión, el suministro y la purificación de polipéptidos diana La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/472.495 presentada el 22 de mayo de 2003.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la expresión, purificación y biología molecular de proteínas. Específicamente, la presente invención se refiere a la expresión de una proteína vehículo en la cual se usa un polipéptido maduro de una enzima termoestable como molécula vehículo para la producción, recuperación y suministro de polipéptidos diana. La molécula vehículo es útil para la producción de secuencias foráneas en diferentes sistemas de expresión y huéspedes incluyendo plantas y cultivos celulares de mamífero.

Antecedentes de la invención Las vacunas son el medio más eficaz para prevenir e incluso eliminar enfermedades infecciosas. Aunque existen varias vacunas eficaces basadas en patógenos completos, es importante el desarrollo de vacunas más seguras, más potentes y rentables basadas en partes de patógeno (vacunas de subunidad) . Durante las últimas dos décadas se han desarrollado varias aproximaciones para la expresión (bacteriana, de levadura, cultivo celular de mamífero y plantas) y suministro (ADN, vectores de virus vivo, proteínas purificadas, partículas víricas vegetales) de antígenos de vacuna. Todas estas aproximaciones tienen impacto significativo sobre el desarrollo y ensayo de vacunas candidatas recién desarrolladas. Sin embargo, existe la necesidad de mejorar los sistemas de expresión y suministro para crear vacunas más eficaces pero más seguras con menos efectos secundarios. Algunas de las características deseadas de las vacunas futuras son (a) que sean altamente eficaces (que estimulen ambos brazos del sistema inmune) , (b) que tengan composición genética conocida y controlada, (c) que tengan eficacia temporal del sistema,

(d) que sean adecuadas para la expresión tanto de péptidos de tamaño pequeño como de polipéptidos de tamaño grande, (e) que sean adecuadas para la expresión en diferentes sistemas (bacterias, levaduras, cultivos celulares de mamífero, vectores de virus vivo, vectores de ADN, plantas transgénicas y vectores de expresión transitoria) , y (f) que sean capaces de formar estructuras tales como agregados y partículas tipo virus que sean fáciles de recuperar y sean inmunogénicas.

Por tanto, existe la necesidad de nuevas moléculas vehículo para el diseño por ingeniería, desarrollo y suministro de vacunas eficaces de subunidad. Estas moléculas vehículo deben proporcionar ventajas y flexibilidad para: expresar cantidades comercialmente suficientes de polipéptidos diana en diferentes sistemas, recuperación económica de polipéptidos diana del material fuente, acomodar polipéptidos de diferente tamaño (4 aminoácidos y mayores) , acomodar repeticiones en tándem de polipéptidos diana, proporcionar función inmune potenciada, usar como herramienta de selección de alto rendimiento, y usar como herramienta de suministro para antígenos de vacuna y marcadores de enfermedad.

Sumario de la invención En la presente invención, se ha descubierto una nueva proteína recombinante. Servirá como molécula vehículo para la expresión y recuperación de polipéptidos diana útiles para su uso como agentes terapéuticos o preventivos contra enfermedades infecciosas o incluso cáncer. La molécula vehículo descubierta en el presente documento puede acomodar polipéptidos de tamaños variables (de 4 aminoácidos a una proteína de 100 kD y superior) (polipéptidos diana) y puede expresarse en diferentes sistemas. Los polipéptidos diana pueden ser antígenos de vacuna.

En un aspecto general, la presente invención proporciona una molécula vehículo recombinante que tiene un polipéptido maduro modificado de una enzima termoestable que carece de uno o más segmentos de aminoácidos o un polipéptido maduro sustancialmente completo de la enzima termoestable adecuada para su fusión con un polipéptido heterólogo en cada uno de los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido maduro, y opcionalmente en la región bucle. El polipéptido maduro modificado y el polipéptido maduro sustancialmente completo retienen su termoestabilidad y/o actividad enzimática. El polipéptido maduro está modificado de tal modo que carece de una región bucle o tiene una región bucle alterada, o tiene al menos un sitio de restricción en la región bucle no presente de forma natural en la enzima termoestable de tipo silvestre.

En una realización preferida, la molécula vehículo descubierta en el presente documento se basa en el gen de la liquinasa B (licB) de Clostridium thermocellum (acceso: X63355, [gi:40697]) . Se ha descubierto que esta enzima bacteriana termoestable puede usarse como molécula vehículo para producir polipéptidos diana. Tiene estructura de bucle expuesta en la superficie que está localizada lejos del dominio activo. Se ha descubierto que esta estructura de bucle puede usarse para la inserción de polipéptidos diana. Los polipéptidos diana pueden expresarse como fusiones N o C terminales o fusiones internas y/o como insertos dentro de la estructura de bucle. La proteína modificada se expresa y caracteriza por cualquiera de los parámetros tales como termoestabilidad, pH y condiciones de temperatura para la actividad óptima. La proteína modificada por ingeniería retenía su pH y condiciones de temperatura para la actividad óptima. Tampoco cambiaba su termoestabilidad a 65 ºC.

Por consiguiente, la presente invención desvela una molécula recombinante derivada de una enzima termoestable para su uso como vehículo para diversos polipéptidos diana heterólogos (por ejemplo, vacunas, hormonas, anticoagulantes, inmunoglobulinas, interferones, interleuquinas, factores de crecimiento hematopoyéticos, etc.) . En realizaciones específicas, desvela Rec LicB y LicKM. La proteína vehículo (es decir, Rec LicB o LicKM modificada o diseñada por ingeniería ligada a uno o más polipéptidos diana heterólogos) es una proteína de fusión y puede expresarse en sistemas procariotas o eucariotas. Específicamente, se ha descubierto que estas moléculas vehículo pueden acomodar polipéptidos de tamaño pequeño a grande de hasta 100 kD y más, pueden acomodar repeticiones en tándem del mismo polipéptido, pueden expresarse en diferentes sistemas, incluyendo bacterias, levaduras, baculovirus, cultivos celulares de mamífero, plantas, ADN y vectores virales, pueden proporcionar ventajas económicas para la recuperación del producto diana debido a su termoestabilidad o capacidad para formar agregados, pueden usarse como sistema de alto rendimiento para seleccionar polipéptidos diana; antígenos, marcadores de enfermedad u otros polipéptidos terapéuticos.

La presente invención también desvela un procedimiento para expresar péptidos como proteínas de fusión, usando un polipéptido maduro recombinante de una enzima termoestable como vehículo para el polipéptido o polipéptidos heterólogos y usando los procedimientos de expresión de péptidos descritos en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. A: Representación esquemática de la modificación por ingeniería de la molécula vehículo LicKM recombinante. 1 es la estructura de bucle. A indica la región cadena arriba de la estructura de bucle. C indica la región cadena abajo de la estructura de bucle. Para crear LicKM, el gen que codifica Lic B se dividió en la región bucle y se ensambló como se muestra. Se crearon sitios de clonación únicos durante la modificación por ingeniería. La secuencia de ácido nucleico para la molécula modificada por ingeniería LicKM (SEC ID Nº:1) se muestra en la parte B de la figura. La división se hizo por PCR usando cebadores específicos. La PCR produjo 2 subclones (fig. 1A) denominados A (159 nucleótidos. 364 a 522) y C (486 nucleótidos, 523 a 1009) . En el clon final el fragmento A se clonó cadena abajo del fragmento C conservando la composición original de aminoácidos.

La Figura 1C muestra la construcción de Rec LicB a partir de LicB de tipo silvestre. La Rec LicB consta de la proteína madura sin el dominio de unión a celulosoma. Las secuencias diana pueden fusionarse al extremo N y C así como en la estructura de bucle usando sitios de restricción BamHI y BglII. La Figura 1D muestra la secuencia de ácido nucleico para la molécula modificada por ingeniería Rec LicB (SEC ID Nº:2) . La Figura 1E muestra una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:3) codificada por el ácido nucleico de LicKM (SEC ID Nº:1) . La Figura 1F muestra una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:4) codificada por Rec LicB (SEC ID Nº:2) . La Figura... [Seguir leyendo]

1. Una proteína vehículo que comprende:

(a) un polipéptido de liquenasa B que consiste en un polipéptido con al menos un 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los aminoácidos 14-231 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 E y los aminoácidos 8-226 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 H; opcionalmente fusionado a

(b) una secuencia polipeptídica heteróloga que no se halla en el polipéptido de liquenasa B.

2. Una proteína vehículo de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

(a) un polipéptido de liquenasa B que consiste en un polipéptido con al menos un 80 % de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los aminoácidos 14-231 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1E y los aminoácidos 8-226 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1H; fusionado a

(b) una secuencia polipeptídica heteróloga que no se halla en el polipéptido de liquenasa B.

3. La proteína vehículo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que el polipéptido de liquenasa B consiste en un polipéptido con al menos un 90 % de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los aminoácidos 14-231 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 E y los aminoácidos 8-226 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1H.

4. La proteína vehículo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en la que el polipéptido de liquenasa B consiste en un polipéptido con al menos un 95 % de identidad de secuencia con un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en los aminoácidos 14-231 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1E y los aminoácidos 8-226 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 H.

5. La proteína vehículo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido de liquenasa B tiene la secuencia de los aminoácidos 14-231 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1E o de los aminoácidos 8-226 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 H.

6. La proteína vehículo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia polipeptídica heteróloga comprende un factor de crecimiento; citoquina; ligando; receptor; inhibidor; antígeno; epítopo; epítopo de linfocito T; epítopo de linfocito B; anticuerpo; hidrolasa; proteína fluorescente verde; interferón; interleuquina; proteína asociada a patógeno; o toxina.

7. La proteína vehículo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia polipeptídica heteróloga comprende un antígeno de vacuna.

8. Un ácido nucleico que codifica la proteína vehículo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. El ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde el ácido nucleico comprende los nucleótido.

5. 703 de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 B o los nucleótido.

3. 697 de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 G.

10. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 8 o de la reivindicación 9.

11. El vector de expresión de la reivindicación 10, en donde el vector es un vector de virus vegetal.

12. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 10 u 11.

13. La célula huésped de la reivindicación 12, en donde la célula huésped es una célula vegetal.

14. Una proteína vehículo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en terapia.

15. La proteína vehículo para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la proteína vehículo es para su uso en la estimulación de una respuesta inmune en un animal.

16. Un procedimiento para la producción de una proteína vehículo en una planta que comprende:

(a) proporcionar una planta que contiene un casete de expresión que tiene un ácido nucleico que codifica la proteína vehículo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 unido de forma funcional a un promotor de modo que la expresión del casete provoca la expresión de la proteína vehículo; y

(b) cultivar dicha planta en condiciones en que se expresa el ácido nucleico y se produce la proteína vehículo.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el promotor se selecciona entre el grupo que consiste en promotores constitutivos de plantas, promotores específicos de tejido vegetal y promotores de virus vegetales.

18. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la proteína vehículo se expresa en una hoja, raíz o semilla de la planta.