Miembro de la familia de desaturasa de ácido graso fad6 y usos del mismo.

Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de

a) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:

7, o uncomplemento de la misma;

b) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidosde la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma;

c) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 %idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde lamolécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa Δ6;

d) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidosque es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, o un complementode la misma, en donde el polipéptido tiene una actividad desaturasa Δ6;

e) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleicoaislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa Δ6;

f) una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones exigentes al complemento de la secuencia denucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aisladacodifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa Δ6; y

g) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ IDNO: 8, en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa Δ6.

Miembro de la familia de desaturasa de ácido graso fad6 y usos del mismo Antecedentes de la Invención Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos con grupos laterales de hidrocarburo de cadena larga y cumplen una función fundamental en muchos procesos biológicos. Los ácidos grasos son raramente libres en la naturaleza pero, en cambio, ocurren en forma esterificada como el componente principal de los lípidos. Los ácidos grasos/ lípidos son fuentes de energía (por ejemplo, oxidación b) y son una parte integral de las membranas de célula que son indispensables para procesar la información biológica o bioquímica.

Los ácidos grasos se pueden dividir en dos grupos: los ácidos grasos saturados y los ácidos grasos insaturados que contienen uno o más enlaces dobles de carbono en la configuración cis. Los ácidos grasos insaturados se producen por desaturasas terminales que pertenecen a la clase de enzimas sin hemo-hierro. Cada una de estas enzimas son parte de un sistema de transporte de electrones que contiene dos de otras proteínas, a saber citocromo b5 y NADHcitocromo b5 reductasa. Específicamente, dichas enzimas catalizan la formación de enlaces dobles entre los átomos de carbono de una molécula de ácido graso. El humano y otros mamíferos tienen un espectro limitado de estas desaturasas que se requieren para la formación de enlaces dobles particulares en los ácidos grasos insaturados. Sin embargo, los humanos toman algunos ácidos grasos, a través de su dieta. Dichos ácidos grasos esenciales, por ejemplo, son ácido linoleico (C18:2) ; ácido linolénico (C18:3) , ácido araquidónico (C20:4) . En contraste, los insectos y plantas son capaces de sintetizar una variedad mucho mayor de ácidos grasos insaturados y sus derivados.

Los ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (LCPUFA) tal como ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19) ) son componentes esenciales de las membranas celulares de diversos tejidos y organelos en los mamíferos (células inmunes, nervio, retina y cerebro) . Por ejemplo, más de 30 % de los ácidos grasos en fosfolípidos en el cerebro son 22:6 (n-3) y 20:4 (n-6) . (Crawford, M.A., et al., (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66: 1032S1041S) . En la retina, el DHA cuenta más de 60 % de los ácidos grasos totales en el segmento externo de los bastones, la parte fotosensible de la célula fotorreceptora. (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315-391) . Los estudios clínicos han mostrado que el DHA es esencial para el crecimiento y desarrollo del cerebro en los niños, y para el mantenimiento de la función cerebral normal en los adultos (Martinetz, M. (1992) J. Pediatr. 120:S129-S138) . El DHA también tiene efectos significativos en la función fotorreceptora implicada en el proceso de transducción de señal, la activación de rodopsina, y el desarrollo de bastones y conos (Giusto, N.M., et al. (2000) Prog. Lipid Res. 39: 315-391) . Adicionalmente, también se encuentran algunos efectos positivos del DHA en enfermedades tales como hipertensión, artritis, aterosclerosis, depresión, trombosis y cánceres (Horrocks, L.A. y Yeo, Y.K. (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215) . Por lo tanto, el suministro dietario apropiado del ácido graso es importante para los humanos para permanecer saludables. Es particularmente importante para los niños, jóvenes y ciudadanos mayores absorber adecuadamente estos ácidos grasos de la dieta debido a que no se pueden sintetizar eficientemente en su cuerpo ni se pueden complementar por los alimentos (Spector, A.A. (1999) Lipids 34: S1-S3) .

El DHA es un ácido graso de las serie n-3 de acuerdo con la ubicación del último enlace doble en el extremo metilo. Este se sintetiza por medio de etapas alternantes de desaturación y elongación. Partiendo de 18:3 (9, 12, 15) , la biosíntesis de DHA implica la desaturación M6 a 18:4 (6, 9, 12, 15) , seguido por elongación a 20:4 (8, 11, 14, 17) y desaturación M5 a 20:5 (5, 8, 11, 14, 17) . Más allá de este punto, existen algunas controversias a cerca de la biosíntesis. La vista convencional es que 20:5 (5, 8, 11, 14, 17) se elonga a 22:5 (7, 10, 13, 16, 19) y luego se convierte a 22:6 (4, 7, 10, 13, 16, 19) por la desaturación final M4 (Horrobin, D.F. (1992) Prog. Lipid Res. 31:163-194) . Sin embargo, Sprecher et al. sugirió recientemente una ruta alternativa para la biosíntesis de DHA, que es independiente de la desaturasa M4, que implica dos elongaciones consecutivas, una desaturación M6 y un acortamiento de dos carbonos por medio de la oxidación º limitada en peroxisoma (Sprecher, H., et al. (1995) J. Lipid Res. 36:2471-2477; Sprecher, H., et al. (1999) Lipids 34:5153-5156) .

La producción de DHA es importante debido a su efecto beneficioso en la salud humana. Actualmente las fuentes principales de DHA son aceites de pescado y algas. El aceite de pescado es una fuente tradicional y principal para este ácido graso, sin embargo, se oxida usualmente por el tiempo en el que se vende. Adicionalmente, el suministro del aceite es altamente variable y su fuente está en peligro con la disminución de poblaciones de peces mientras que la fuente de algas es costosa debido a la baja producción y los altos costes de extracción.

El EPA y AA son ambos ácidos grasos esenciales M5. Estos forman una clase única de constituyentes de alimentos y comida para humanos y animales. El EPA que pertenece a la serie n-3 con cinco enlaces dobles en la cadena acilo, se encuentra en la comida marina, y es abundante en aceite de pescado en el Atlántico Norte. El AA pertenece a la serie n-6 con cuatro enlaces dobles. La carencia de un enlace doble en la posición w-3 confiere diferentes propiedades AA que aquellas encontradas en EPA. Los eicosanoides producidos de AA tienen propiedades agregadas a plaqueta y fuertemente inflamatorias, mientras que aquellos derivados de EPA tienen propiedades agregadas anti-plaqueta e anti-inflamatorias. Se puede obtener AA de algunos alimentos tal como carne, pescado, y huevos, pero la concentración es baja.

El ácido gama-linolénico (GLA) es otro ácido graso esencial encontrado en mamíferos. El GLA es el intermedio metabólico para ácidos grasos n-6 de cadena muy larga y para diversas moléculas activas. En los mamíferos, la formación de ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga se limita en índice por la desaturación M6. Muchas afecciones o condiciones patológicas y fisiológicas tal como envejecimiento, estrés, diabetes, eczema, y algunas infecciones han mostrado que reducen la etapa de desaturación M6. Adicionalmente, el GLA se cataboliza fácilmente de la oxidación y división celular rápida asociada con ciertos trastornos, por ejemplo, cáncer o inflamación. Por lo tanto, la complementación dietética con GLA puede reducir los riesgos de estos trastornos. Los estudios clínicos han mostrado que la complementación dietética con GLA es efectiva en tratar algunas afecciones patológicas tal como eczema atópico, síndrome premenstrual, diabetes, hipercolesterolemia, y trastornos cardiovasculares e inflamatorios.

Las fuentes predominantes de GLA son aceites de plantas tal como onagra (Oenothera biennis) , borraja (Borago officinalis L.) , grosella negra (Ribes nigrum) , y de microorganismos tal como Mortierella sp., Mucor sp., y

Cyanobacteria. Sin embargo, estas fuentes GLA no son ideales para complementación dietaria debido a grandes fluctuaciones en la disponibilidad y costes asociados con los procesos de extracción.

Las enzimas desaturasa, en particular desaturasas M6, se describen por ejemplo en el documento WO 00/20602, en el documento WO 98/46764, en Sayanova et al., Proc. Natl .Acad. Sci. USA vol. 94, 1 Abril 1997, páginas 42114216, en Sakuradani et al., Gene vol. 238, no. 2, 1 Enero 1999, páginas 445-453 y en Huang et al., Lipids vol. 34, no. 7, 1 Julio 1999, páginas 649-659.

Resumen de la invención La biosíntesis de ácidos grasos es una actividad principal de plantas y microorganismos. Sin embargo, los humanos tienen una capacidad limitada para sintetizar ácidos grasos esenciales, por ejemplo, ácidos grasos poli-insaturados de cadena larga (LCPUFA) . La biotecnología se ha considerado una forma eficiente para manipular el proceso para producir ácidos grasos en plantas y microorganismos. Es efectiva en costes y renovable con pocos efectos colaterales. Sin embargo, ha surgido tremendo esfuerzo industrial dirigido a la producción de diversos compuestos que incluyen ácidos grasos y polipéptidos farmacéuticos de especialidades a través de la manipulación de células de planta, animal, y microorganismos. De acuerdo con lo anterior, la biotecnología es una ruta atractiva para producir ácidos grasos insaturados, especialmente LCPUFA, en una forma segura, eficiente en costes con el fin de reunir valor terapéutico máximo de... [Seguir leyendo]

1. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de

a) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma;

b) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma;

c) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6;

d) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, o un complemento de la misma, en donde el polipéptido tiene una actividad desaturasa M6;

e) una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de por lo menos 30 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6;

f) una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida bajo condiciones exigentes al complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, o un complemento de la misma, en donde la molécula de ácido nucleico aislada codifica un polipéptido que tiene una actividad desaturasa M6; y

g) una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa M6.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el polipéptido o fragmento que tiene una actividad desaturasa M6 codificada por la molécula de ácido nucleico comprende por lo menos un motivo representado por los residuos de aminoácido seleccionados del grupo que consiste de los residuo.

4. 47 de la SEQ ID NO: 8, los residuo.

17. 183 de la SEQ ID NO: 8, los residuo.

21. 220 de la SEQ ID NO: 8 y los residuo.

40. 405 de la SEQ ID NO: 8; o en donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende por lo menos uno de un motivo de unión hemo o un motivo histidina que tiene por lo menos dos residuos de aminoácido histidina;

o en donde la molécula de ácido nucleico codifica una molécula de desaturasa de ácido graso M6 capaz de convertir ácido linoleico (18:2) a ácido gama linoleico (GLA) (18:3 (6, 9, 12) ) o ácido a-linolenico (ALA) (18:3) a ácido estearidónico (SDA) (18:4 (6, 9, 12, 15) ) .

3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el vector es opcionalmente un vector de expresión.

4. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión de la reivindicación 3, en donde la célula se selecciona opcionalmente del grupo que consiste de una célula de planta, una célula microbiana, y una célula de animal.

5. La célula anfitriona de la reivindicación 4, en donde la célula de planta es una célula obtenida de un cultivo de oleaginosa seleccionado del grupo que consiste de lino (Linum sp.) , Brassica napus, Brassica juncea, semilla de colza (Brassica sp.) , soja (Glycine y Soja sp.) , girasol (Helianthus sp.) , algodón (Gossypium sp.) , maíz (Zea mays) , oliva (Olea sp.) , alazor (Carthamus sp.) , cacao (Theobroma cocoa) , y cacahuete (Arachis sp.) , o en donde la célula microbiana se selecciona del grupo que consiste de Thraustochytrium, Pythium, Schizochytrium, y Cr y thecodinium.

6. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste de

a) un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8;

b) un polipéptido aislado codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6;

c) un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 50 % idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de la SEQ ID NO: 8, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6;

d) un polipéptido aislado que se codifica por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos que es por lo menos 65 % idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de la SEQ ID NO: 7, en donde el polipéptido aislado tiene una actividad desaturasa M6; y

e) un polipéptido aislado que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, en donde el fragmento tiene una actividad desaturasa M6.

7. Un método para producir el polipéptido aislado de la reivindicación 6, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 4 para producir dicho polipéptido.

8. El polipéptido aislado de la reivindicación 6, en donde el polipéptido comprende por lo menos un motivo representado por los residuos de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de los residuo.

4. 47 de la SEQ ID NO: 8, los residuo.

17. 183 de la SEQ ID NO: 8, los residuo.

21. 220 de la SEQ ID NO: 8 y los residuo.

40. 405 de la SEQ ID NO: 8; o en donde el polipéptido comprende por lo menos uno de un motivo de unión hemo o un motivo histidina que tiene por lo menos dos residuos de aminoácido histidina; o en donde el polipéptido es una molécula de desaturasa de ácido graso M6 capaz de convertir ácido linoleico (18:2) a ácido gama linoleico (GLA) (18:3 (6, 9, 12) ) o ácido a-linolenico (ALA) (18:3) a ácido estearidónico (SDA) (18:4 (6, 9, 12, 15) ) .

9. Un método para producir un ácido graso insaturado que comprende (i) cultivar o cosechar la célula anfitriona de la reivindicación 4 bajo condiciones de tal manera que se produce el ácido graso insaturado, o (ii) poner en contacto una composición que comprende por lo menos una molécula objetivo desaturasa con por lo menos un polipéptido aislado de la reivindicación 6 bajo condiciones de tal manera que se produce el ácido graso insaturado, o

(iii) transfectar o transformar una célula con la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 y cultivar o cosechar la célula bajo condiciones de tal manera que se produce el ácido graso insaturado.

10. Un método para mejorar la producción de un ácido graso insaturado que comprende cultivar o cosechar la célula anfitriona de la reivindicación 4, de tal manera que se mejora la producción de un ácido graso insaturado.

11. Un método para producir una célula capaz de generar un ácido graso insaturado que comprende introducir dentro de dicha célula la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico codifica una desaturasa que tiene una actividad de catalizar la formación de un enlace doble en una cadena grasa acilo.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el ácido graso insaturado se selecciona del grupo que consiste de GLA (18:3 (6, 9, 12) ) , SDA (18:4 (6, 9, 12, 15) ) , AA (20:4 (5, 8, 11, 14) ) y EPA (20:5 (5, 8, 11, 14, 17) ) .

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende adicionalmente recuperar el ácido graso insaturado.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9, parte (i) o (ii) , o 10-11, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula de planta, por ejemplo, una planta de oleaginosa, una célula de animal y una célula microbiana.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la planta de oleaginosa se selecciona del grupo que consiste de lino (Linum sp.) , semilla de colza (Brassica sp.) , soja (Glycine y Soja sp.) , girasol (Helianthus sp.) , algodón (Gossypium sp.) , maíz (Zea mays) , oliva (Olea sp.) , alazor (Carthamus sp.) , cocao (Theobroma cocoa) , y cacahuete (Arachis sp.) .

16. Una composición que comprende el polipéptido de la reivindicación 6.

17. Una composición que comprende la célula producida por el método de la reivindicación 11.

18. La composición de la reivindicación 16 para uso como un complemento dietario o para uso como alimento para animal.

19. La composición de la reivindicación 16 para uso en el tratamiento de un paciente que tiene un trastorno, en donde el trastorno se selecciona opcionalmente del grupo que consiste de estrés, diabetes, cáncer, trastornos inflamatorios, y trastornos cardiovasculares.