Métodos para preparar factor X, factor X activado, factor X inactivado y factor Xa inactivado.

Un método para la separación de factor X humano de un material de partida que comprende factor X yprotrombina,

comprendiendo el método

a) adsorber el material de partida sobre un substrato de cromatografía de afinidad de ion metálicoinmovilizado;

b) eluir las proteínas adsorbidas seleccionadas del substrato por reducción de la fuerza iónica y/o cambiodel pH del tampón de elución;

c) monitorizar el eluato para ver el comienzo de la elución de protrombina y factor X, desechando unaprimera porción del eluato y recogiendo una segunda porción subsecuente del eluato enriquecida en factorX; y

d) retirar la protrombina residual en el factor X obtenido en la etapa c) por cromatografía de intercambioaniónico.

Métodos para preparar factor X, factor X activado, factor X inactivado y factor Xa inactivado La presente invención se refiere a métodos para preparar factor X humano, factor X humano activado (factor Xa) , factor X humano inactivado y factor Xa humano inactivado.

El factor X es un factor de coagulación normalmente presente en sangre humana. La deficiencia del Factor X es un raro trastorno hemorrágico que afecta a 1 en 500.000 y 1 en 1.000.000 de la población. Está caracterizado por una tendencia a la hemorragia excesiva, similar al causado por las deficiencias del factor VIII y factor IX en la hemofilia A y B respectivamente. No hay actualmente tratamientos autorizados específicamente para la deficiencia del factor X en ninguna parte del mundo. En particular, no hay concentrados clínicos de factor X actualmente disponibles para su uso en el tratamiento de la deficiencia de factor X. En su lugar, los médicos tienen que confiar en infusiones de plasma o de concentrados de complejo de protrombina (PCC) . Sin embargo, hay varias desventajas que acompañan al uso de plasma o PCC para el tratamiento de la deficiencia de factor X.

El plasma contiene solo una baja concentración de factor X (aproximadamente 1 unidad por ml) , de modo que se necesita un gran volumen de infusión para conseguir incluso un pequeño incremento en el nivel de factor X circulante de un paciente. El tratamiento está condicionado por la necesidad de parar la infusión antes de que se haya suministrado una dosis terapéutica total, para evitar la sobrecarga de volumen que provoca desequilibrio osmótico y daño pulmonar agudo relacionado con la transfusión. El plasma también requiere almacenamiento refrigerado o congelado que puede restringir la disponibilidad para el paciente.

Los concentrados de complejo de protrombina (PCC) contienen algo de factor X, pero este es solo un componente muy minoritario de la proteína total presente. Los PCCs no están ensayados o etiquetados para esta indicación lo que conduce a una dosis muy variable. Muchos de estos productos más viejos están preparados de plasma mezclado sin el margen de seguridad añadido de múltiples etapas de inactivación de virus durante la fabricación. La mayor parte requieren almacenamiento refrigerado que, como con el plasma, puede restringir la disponibilidad para el paciente. Como el principal constituyente del PCC es protrombina, y los PCCs tienen el riesgo de ser parcialmente activados por el procedimiento de fabricación, hay un riesgo de que el uso de PCC dé como resultado un efecto secundario trombótico durante el tratamiento, que podría ser fatal. Aunque el PCC contiene más factor X humano que el plasma en el volumen disponible, es deseable que contenga la dosis terapéutica en un volumen tan pequeño como sea posible, particularmente cuando muchos de los pacientes tratados son niños pequeños.

El documento WO 89/05650 describe un método para por lo menos separar parcialmente factores de coagulación sanguínea dependientes de vitamina K, incluyendo el Factor X, de una mezcla que contiene por lo menos uno de tales factores, por ejemplo, un concentrado de complejo de protrombina. El método comprende la adsorción de la mezcla sobre una columna de cromatografía de quelato metálico. Sin embargo, el factor X producido según el método del documento WO 89/05650 aún contiene significativas cantidades de protrombina, hasta 40-50% en peso. La presencia de protrombina en un concentrado de factor X es indeseable porque la protrombina tiene una semivida media en circulación mayor que el factor X. Si un paciente es infundido con tratamiento que contiene ambas proteínas, esto puede provocar un desproporcionado y acumulativo incremento de protrombina en plasma que puede desequilibrar entonces el equilibrio hemostático en favor de la generación de trombina y la formación de coágulo (hemostasis/trombosis) . Sería deseable la retirada o reducción de protrombina en un concentrado de factor X para minimizar el riesgo de generación espontánea de trombina durante la fabricación o almacenamiento del producto, que podría provocar también reacciones trombóticas durante el uso clínico.

El documento EP 0617049 describe un procedimiento para la purificación del factor IX, factor X y factor II de sus fracciones de plasma humano que comprende separaciones cromatográficas de intercambio aniónico seguidas de cromatografía en resina de adsorción selectiva.

FELDMAN. P. A. ET AL.: “Preparation of a high purity factor X concentrate using metal chelate affinity chromatography” Biotechnology of blood proteins, XX, XX, Vol. 227, 1 Januar y , 1993, páginas 63-68, describe la purificación de factor IX de plasma empobrecido crioprecipitado usando cromatografía de intercambio aniónico en DEAE-Sefarosa y cromatografía de afinidad de ion metálico.

El documento WO 94/01466 describe un procedimiento para activar factor II a factor IIa incubando factor II en presencia de factor V, factor Xa, fosfolípidos e iones calcio.

El documento WO 2004/050904 describe un procedimiento para la preparación de disolución purificada de protrombina y factor X de una fracción de plasma sanguíneo que comprende cromatografía de gel de quelato metálico y cromatrografía de gel de afinidad.

El documento WO 2006/067230 describe la preparación de composiciones de proteína dependiente de vitamina K con bajo contenido de contaminantes proteínicos.

El documento WO 96/13274 describe un procedimiento para producir una preparación muy purificada de una forma inhibida de un factor sanguíneo activado.

El documento WO 01/51067 describe una composición anticoagulante que comprende por lo menos dos factores sanguíneos inactivados y métodos para su preparación.

El documento WO 90/15619 describe una composición anticoagulante que contiene factor Xa que tiene el sitio de serina activa inactivado.

KAISER. B. ET AL.:”Inactivation of factor Xa by the synthetic inhibitor DX-9065a causes strong anticoagulant and antiplatelet actions in human blood”. BLOOD COAGULATION AND FIBRINOLYSIS, Vol. 10, no. 8, December 1999, páginas 495-501, describe los efectos anticoagulantes y antiplaquetas del inhibidor directo del factor Xa DX-9065a en plasma humano usando ensayos de coagulación global.

AHMAD. S ET AL.: “Rapid purification of factor IX, factor X y prothrombin by immunoaffinity and ion Exchange chromatography”, THROMBOSIS RESEARCH, TARRYTOWN, NY, US, Vol. 55, no.1, 1 July 1989, páginas 121-133, describe la purificación de factor IX humano de plasma.

MILETICH J. P ET AL.: “The synthesis of sulfated dextran beads for isolation of human plasma coagulation factors II, IX and X”, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, Vol. 105, no. 1, 1 June 1980, páginas 304-310, describe una nueva matriz para la cromatografía de factores de coagulación.

ESNOUF. M. P. ET AL.: “A method for the simultaneous isolation of factor X and prothrombin from bovine plasma”, BIOCHEMICAL JOURNAL, Vol. 131, no. 4, 1973, páginas 781-789, describe el aislamiento por cromatografía sobre DEAE-Sefadex y purificada adicionalmente por cromatografía en DEAE-Sefadex 2.

BAJAJ S. P. ET AL.: “Simultaneous purification of bovine prothrombin and factor X. Activation of prothrombin by tr y psin-activated factor X”, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 248, no. 22, 25 november 1973, páginas 7729-7741, describe el aislamiento por cromatografía en DEAE-celulosa y purificación adicional del factor X bovino por cromatografía en DEAE-Sefadex.

Por lo tanto es necesario aún un procedimiento para la preparación de factor X que sea eficiente, se pueda llevar a cabo a escala industrial, que permita la incorporación de múltiples etapas de reducción de virus y que proporcione un producto farmacéuticamente útil.

En un aspecto, la invención por lo tanto proporciona un método para la separación de factor X humano de un material de partida que comprende factor X humano y protrombina, comprendiendo el método el uso de cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado (IMAC, denominada también cromatografía de quelato metálico) . El método comprende:

a) adsorber el material de partida sobre un substrato de cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado;

b) eluir las proteínas adsorbidas seleccionadas del substrato por reducción de la fuerza iónica y/o cambio de pH del tampón de elución;

c) monitorizar el eluato para ver el comienzo de la elución de protrombina y factor X, desechando una primera porción del eluato y recogiendo una segunda porción subsecuente del eluato enriquecida en factor X; y

d) retirar la protrombina residual en... [Seguir leyendo]

1. Un método para la separación de factor X humano de un material de partida que comprende factor X y protrombina, comprendiendo el método a) adsorber el material de partida sobre un substrato de cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado;

b) eluir las proteínas adsorbidas seleccionadas del substrato por reducción de la fuerza iónica y/o cambio del pH del tampón de elución;

c) monitorizar el eluato para ver el comienzo de la elución de protrombina y factor X, desechando una primera porción del eluato y recogiendo una segunda porción subsecuente del eluato enriquecida en factor X; y

d) retirar la protrombina residual en el factor X obtenido en la etapa c) por cromatografía de intercambio aniónico.

2. Un método según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente por lo menos una etapa para la reducción o inactivación de virus.

3. Un método según la reivindicación 1 que comprende: i) tratamiento con detergente/disolvente del material de partida que comprende factor X y protrombina; ii) adsorber el material de partida tratado con detergente/disolvente sobre un substrato de cromatografía de afinidad de ion metálico inmovilizado; iii) eluir proteínas adsorbidas del substrato; iv) monitorizar el eluato para ver el comienzo de la elución de protrombina/factor X, desechando una

primera porción del eluato y recogiendo una subsecuente segunda porción del eluato enriquecida en factor

X; v) retirar la protrombina residual en la segunda porción del eluato llevando a cabo cromatografía de intercambio aniónico;

vi) filtrar el producto de la etapa v) a través de un filtro de retención de virus; vii) liofilizar el producto filtrado de la etapa vi) , opcionalmente en presencia de uno o más estabilizantes; y viii) someter el producto liofilizado a una etapa de tratamiento térmico de inactivación/reducción de virus.

4. Un método según cualquier reivindicación precedente en el que el material de partida es una fracción de plasma.

5. Un método según cualquier reivindicación precedente en el que el material de partida es un complejo de protrombina.

6. Un método según cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente una etapa de activación para activar el factor X.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que el factor X es activado por un ion metálico divalente solo o en combinación con un veneno.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que el ion metálico divalente es calcio.

9. Un método según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el veneno es veneno de víbora de Russell.

10. Un método según cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente una etapa de inactivación para inactivar factor X o factor X activado.

11. Un método según cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente preparar una composición farmacéutica que comprende el factor X o factor Xa y uno o más diluyentes, excipientes y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que el estabilizante es sacarosa, trehalosa, dextrano, glicina, polivinilpirrolidona o polietilenglicol.

13. Un método según la reivindicación 11 o 12, en el que la composición es una composición liofilizada.

14. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material de partida es una disolución recogida de un tejido transgénico.

15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el material de partida es una disolución recogida de un medio de cultivo recombinante.