Métodos mejorados para BEAMing.

Método para analizar variaciones de secuencias de nucleótidos,

que comprende:

amplificar una región de moléculas de ADN de analito usando una ADN polimerasa de altafidelidad para formar un conjunto de primeros amplicones;

formar microemulsiones que comprenden dichos primeros amplicones y perlas de reactivo, en elque las perlas de reactivo están unidas a una pluralidad de moléculas de un cebador paraamplificar el conjunto de primeros amplicones;

amplificar los primeros amplicones en las microemulsiones, mediante lo cual se forman perlas deproducto que están unidas a una pluralidad de copias de segundos amplicones;

romper las microemulsiones;

amplificar los segundos amplicones usando amplificación por círculo rodante para formar tercerosamplicones;

determinar una característica de secuencia de los terceros amplicones mediante extensión de unaúnica base de un cebador unido a dichos terceros amplicones usando al menos dosdidesoxirribonucleótidos marcados de manera diferencial.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11191989.

Solicitante: THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: JOHNS HOPKINS TECHNOLOGY TRANSFER 100 N. CHARLES STREET 5TH FLOOR BALTIMORE, MD 21201 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: VOGELSTEIN, BERT, KINZLER, KENNETH, LI, MING, DIEHL,Frank.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12P19/34 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2426031_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Métodos mejorados para BEAMing

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al área de bioquímica analítica y diagnóstico. En particular, se refiere a detectar diferencias sutiles y raras en moléculas de ácido nucleico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La probabilidad de curar cánceres, a través de sólo cirugía, es alta en aquellos individuos cuyos tumores primarios se detectan en un estadio relativamente temprano. Tal detección temprana es por tanto uno de los enfoques más prometedores para limitar la morbilidad y la mortalidad del cáncer en el futuro (1) . En la actualidad, puede usarse la prueba de Papanicolau para detectar cánceres de cuello uterino, la mamografía puede detectar cánceres de mama, los niveles de PSA sérico pueden significar la presencia de cáncer de próstata y la colonoscopia y pruebas de sangre oculta en heces pueden detectar cánceres de colon (2) . Sin embargo, problemas de sensibilidad, especificidad, costes o cumplimiento han complicado la puesta en práctica generalizada de estas pruebas (3-5) . Además, no están aún disponibles métodos para la detección temprana de la mayoría de otros tipos de cáncer.

El descubrimiento de las bases genéticas de la neoplasia ha conducido a nuevos enfoques para detectar tumores de manera no invasiva (6-8) . Muchos de estos enfoques se basan en la detección ex vivo de formas mutantes de los oncogenes y genes supresores de tumores que son responsables del inicio y progresión de los tumores. Este enfoque se usó por primera vez para detectar tumores de vejiga y colon a través del examen de orina y deposiciones, respectivamente (9, 10) , y se ha usado desde entonces para detectar varios otros tipos de tumores (11-14) . Ya que los genes mutantes no sólo son “marcadores” para el cáncer, sino que son las causas directas de crecimiento tumoral (1) , tienen ventajas conceptuales importantes con respecto a marcadores convencionales tales como sangre oculta en heces y PSA sérico. En particular, los marcadores convencionales no están implicados patogénicamente en el proceso tumorigénico y son mucho menos específicos para la neoplasia que las mutaciones.

La evaluación de muestras de sangre de pacientes para detectar moléculas de ADN mutante es un enfoque particularmente atractivo ya que tales pruebas podrían detectar muchas formas de cánceres diferentes. Adicionalmente, puede obtenerse fácilmente sangre de pacientes durante las visitas ambulatorias de rutina y se conocen bien métodos para preparar y almacenar plasma y suero y son fiables. Por consiguiente, numerosos estudios han intentado identificar formas o cantidades anómalas de ADN en plasma o suero (6, 11-15) . Desafortunadamente, los resultados de muchos de estos estudios son contradictorios. Algunos notifican altas tasas de detección de cánceres, otros muy bajas, a pesar del uso de cohortes de pacientes y técnicas similares. Además, varios estudios han mostrado que la pérdida de heterocigosidad puede detectarse de manera rutinaria en ADN circulante, incluso en pacientes con tumores relativamente no agresivos. Para detectar la pérdida de heterocigosidad en tales muestras, las células neoplásicas dentro de un tumor deben contribuir a más del 50% del ADN circulante total.

Los estudios anteriores, aunque prometedores, conducen a varias cuestiones que deben responderse para generar confianza en el uso de ADN anómalo, circulante como biomarcador de tumores malignos. En primer lugar, cuántas copias de un fragmento génico dado están presentes en la circulación en pacientes con cáncer? En segundo lugar, cuál es la naturaleza de este ADN, por ejemplo, intacto frente a degradado? En tercer lugar, qué fracción de estos fragmentos génicos tienen una secuencia de ADN anómala (por ejemplo, mutante) ? Y en cuarto lugar, cómo varía esta fracción con el estadio de la enfermedad? Para responder a estas cuestiones, es necesario desarrollar tecnologías que puedan cuantificar simultáneamente el número de moléculas de ADN normales y mutantes en una muestra dada, incluso cuando la fracción de moléculas mutantes es muy pequeña. Tales ensayos sensibles y precisos para la detección y cuantificación de variantes raras entre un gran exceso de secuencias normales tienen aplicaciones importantes en muchas áreas de investigación biomédica. Los ejemplos en la investigación científica básica incluyen el análisis de la fidelidad de replicación en diversos sistemas in vitro y la determinación de las tasas de mutación en células tras el tratamiento con mutágenos. Los ejemplos en la medicina clínica incluyen la identificación de mutaciones en la sangre, la orina o las deposiciones de pacientes con cáncer y la identificación de secuencias de ADN fetal en el plasma de mujeres embarazadas.

Anteriormente se describió un enfoque, denominado BEAMing (perlas, emulsiones, amplificación e imanes) , que permite la transformación de una población de fragmentos de ADN en una población de perlas que contienen cada una miles de copias de la secuencia idéntica. Se ha mostrado que la población de perlas generadas de este modo representa de manera precisa la población de ADN inicial. Debido a que pueden generarse 108 perlas en un único tubo de ensayo y analizarse mediante citometría de flujo convencional, esta técnica tiene la capacidad de no sólo identificar variaciones genéticas presentes en la población de ADN original, sino también cuantificar de manera precisa su número en comparación con secuencias de tipo natural. Además de su uso para descubrir tales variantes raras, las perlas generadas a través del procedimiento de BEAMing proporcionan moldes excelentes para la secuenciación de nucleótidos, por ejemplo, secuenciación mediante síntesis. Las perlas también pueden usarse

como moldes para ambos métodos de alto rendimiento recientemente descritos para este fin.

Las ventajas de tener tantas copias como sea posible por perla para aplicaciones tanto de citometría de flujo como de secuenciación son claras. Se estima que el número de copias por perla de 1 micrómetro producidas mediante BEAMing es de 104 - 105. Hay una necesidad en la técnica de una técnica que pueda aumentar este número en al menos dos órdenes de magnitud.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Una realización de la invención proporciona un método para analizar variaciones de secuencias de nucleótidos. Se amplifica una región de moléculas de ADN de analito usando una ADN polimerasa de alta fidelidad para formar un conjunto de primeros amplicones. Se forman microemulsiones que comprenden dichos primeros amplicones y perlas de reactivo. Las perlas de reactivo están unidas a una pluralidad de moléculas de un cebador para amplificar el conjunto de primeros amplicones. Los primeros amplicones se amplifican en las microemulsiones. Se forman así perlas de producto que están unidas a una pluralidad de copias de segundos amplicones. Se amplifican los segundos amplicones usando amplificación por círculo rodante para generar terceros amplicones. Se determina una característica de secuencia de los terceros amplicones mediante extensión de una única base de un cebador unido a los terceros amplicones usando al menos dos didesoxirribonucleótidos marcados de manera diferencial.

Esta y otras realizaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras leer la memoria descriptiva que proporciona a la técnica métodos para el análisis, el diagnóstico, y la selección de diferencias en ácidos nucleicos sutiles y raras y las condiciones o agentes que provocan tales diferencias.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Efecto del tamaño de amplicón de PCR sobre la concentración de ADN plasmática y la frecuencia de mutación. (A) Se determinó la concentración de fragmentos de APC totales (tipo natural más mutante) de diversos tamaños usando PCR digital de ADN plasmático de tres pacientes diferentes (pacientes 29, 30 y 32) . (B) Se determinó la fracción de fragmentos de APC mutantes mediante secuenciación digital de productos de PCR.

Figura 2. Esquema del ensayo basado en BEAM. (A) Se prepararon perlas extendidas mediante modificaciones del procedimiento BEAMing descrito en Dressman et al (16) (B) Se realizaron extensiones de una única base en las perlas extendidas (esferas de oro) . Las secuencias de ADN normal contenían una G en la posición investigada, mientras que las secuencias mutantes contenían una A.

Figura 3. Procesamiento de los datos de citometría de flujo obtenidos mediante BEAMing. (A) Gráfico de puntos de las señales de dispersión frontal (FCS) y dispersión lateral (SCC) de las perlas. (B) Histograma de perlas individuales con respecto a la señal de PE. Sólo las perlas que contenían... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para analizar variaciones de secuencias de nucleótidos, que comprende:

amplificar una región de moléculas de ADN de analito usando una ADN polimerasa de alta fidelidad para formar un conjunto de primeros amplicones; formar microemulsiones que comprenden dichos primeros amplicones y perlas de reactivo, en el que las perlas de reactivo están unidas a una pluralidad de moléculas de un cebador para amplificar el conjunto de primeros amplicones; amplificar los primeros amplicones en las microemulsiones, mediante lo cual se forman perlas de producto que están unidas a una pluralidad de copias de segundos amplicones; romper las microemulsiones; amplificar los segundos amplicones usando amplificación por círculo rodante para formar terceros amplicones; determinar una característica de secuencia de los terceros amplicones mediante extensión de una única base de un cebador unido a dichos terceros amplicones usando al menos dos didesoxirribonucleótidos marcados de manera diferencial.

2. Método según la reivindicación 1, en el que las microemulsiones comprenden un agente emulsionante termoestable.

3. Método según la reivindicación 1, en el que:

(1) la polimerasa de alta fidelidad tiene una tasa de error de menos de 10-5 errores por par de bases por ciclo;

(2) la polimerasa de alta fidelidad tiene una tasa de error de menos de 5 x 10-6 errores por par de bases por ciclo; o

(3) la polimerasa de alta fidelidad tiene una tasa de error de menos de 10-6 errores por par de bases por ciclo.

4. Método según la reivindicación 1, en el que:

(1) el primer amplicón es de menos de o igual a 300 pb;

(2) el primer amplicón es de menos de o igual a 200 pb; o

(3) el primer amplicón es de menos de o igual a 100 pb.

5. Método según la reivindicación 1, en el que los didesoxirribonucleótidos marcados son fluorescentes y se usa citometría de flujo para detectar los didesoxirribonucleótidos marcados en las perlas de producto.

6. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de desechar del análisis perlas que presentan dos o más didesoxirribonucleótidos marcados de manera diferencial extendidos en cebadores unidos a segundos amplicones unidos a las perlas.

7. Método según la reivindicación 1, en el que las moléculas de ADN de analito se obtienen a partir de ADN plasmático.

8. Método según la reivindicación 1, en el que las microemulsiones se forman con un homogeneizador de tejidos.

9. Método según la reivindicación 1, en el que:

(1) las microemulsiones se forman con un homogeneizador de tejidos mecánico; o

(2) las microemulsiones se forman con un homogeneizador de tejidos de rotor-estator.

10. Método según la reivindicación 1, en el que se usan dos polimerasas de alta fidelidad en paralelo y se comparan para determinar la fidelidad relativa.

11. Método según la reivindicación 1, en el que el ADN de analito se ha tratado con un posible mutágeno.

12. Método según la reivindicación 1, en el que:

(1) el ADN de analito se obtiene a partir de sangre, orina o heces de un paciente con cáncer; o

(2) el ADN de analito se obtiene a partir de plasma de una mujer embarazada.

13. Método según la reivindicación 1, en el que antes de la etapa de determinación, se someten las perlas de producto a condiciones de desnaturalización mediante lo cual los segundos amplicones se separan en

hebras individuales, y en el que las hebras individuales que no están unidas a las perlas de producto de desechan.

14. Método según la reivindicación 1, en el que antes de la etapa de determinación, se incuban las perlas de producto con didesoxirribonucleótidos no marcados.


 

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