Método para producir L-lisina.

Método para producir L-lisina, que comprende hacer crecer en cultivo en un medio una Escherichia coli que tiene capacidad productora de L-lisina y recoger L-lisina del medio,



en el que la Escherichia coli se ha modificado para disminuir la actividad o actividades de una o más clases de enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-,-diaminopimélico, y

en el que se ha introducido un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa en la Escherichia coli.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2008/063126.

Solicitante: AJINOMOTO CO., INC..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 15-1, KYOBASHI 1-CHOME CHUO-KU TOKYO 104-8315 JAPON.

Inventor/es: DOI,HIDETAKA, UEDA,TAKUJI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/10 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
  • C12N9/90 C12N 9/00 […] › Isomerasas (5.).
  • C12P13/08 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.

PDF original: ES-2403199_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para producir L-lisina.

Campo técnico La presente invención se refiere a un método para producir L-lisina utilizando Escherichia coli. L-Lisina es un aminoácido esencial y se utiliza como componente de fármacos y diversas mezclas nutricionales tales como aditivos de piensos para animales.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos tales como la L-lisina se producen industrialmente mediante fermentación usando bacterias productoras de aminoácidos tales como bacterias corineformes y bacterias Escherichia que tienen capacidad para producir tales L-aminoácidos. Como tales bacterias productoras de aminoácidos se usan cepas aisladas de la naturaleza, cepas mutantes artificiales de tales cepas, cepas recombinantes en las que está potenciada la actividad de las enzimas de biosíntesis de L-aminoácidos mediante recombinación génica, etc., con el fin de obtener productividad mejorada. Los ejemplos de métodos para producir L-lisina incluyen los métodos descritos en los documentos de patente 1 a 4.

Como métodos para mejorar la capacidad para producir aminoácidos tales como L-lisina, además del método de aumentar la expresión de una enzima de una ruta biosintética característica para un aminoácido diana, se ha desarrollado un método de modificación de la ruta de la cadena respiratoria para mejorar la eficacia energética (documento de patente 5) y un método de amplificación de un gen de nicotinamida nucleótido transhidrogenasa para aumentar la capacidad productora de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (documento de patente 6) .

Además, como medio basado en la modificación de una ruta común a la biosíntesis de diversos aminoácidos, se conocen bacterias productoras de L-aminoácidos en las que está modificada la ruta anaplerótica, tal como la bacteria corineforme productora de L-lisina en la que está aumentada la actividad piruvato (documento de patente 7) , la bacteria Escherichia productora de L-lisina deficiente en piruvato cinasa (documento de patente 8) y la bacteria corineforme productora de L-lisina que es deficiente en maleato quinona oxidorreductasa (documento de patente 9) .

Como precursor de L-lisina, está el ácido meso- , -diaminopimélico (también denominado en lo sucesivo “meso-DAP”) . Meso-DAP es un precursor de L-lisina, y al mismo tiempo, es una sustancia indispensable para el crecimiento de bacterias como componente constituyente de las paredes celulares. En cuanto a la síntesis de meso-DAP en bacterias Escherichia, se sabe que meso-DAP se sintetiza a partir de un precursor del mismo, el ácido 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxílico (también denominado en lo sucesivo “THDP”) , mediante las funciones de cuatro enzimas, 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa (también denominada en lo sucesivo “DapD”, documento no de patente 1) , succinildiaminopimelato transaminasa (también denominada en lo sucesivo “DapC”, documento no de patente 2) , succinildiaminopimelato desuccinilasa (también denominada en lo sucesivo “DapE”, documento no de patente 3) y diaminopimelato epimerasa (también denominada en lo sucesivo “DapF”, documento no de patente 4) , que pertenecen a la ruta de síntesis de meso-DAP. Se ha esclarecido que las bacterias corineformes tienen otra ruta de síntesis de meso-DAP que utiliza THDP como precursor y sintetizan meso-DAP a partir de THDP mediante una reacción de una etapa usando meso-DAP deshidrogenasa (también denominada en lo sucesivo “diaminopimelato deshidrogenasa” o “DDH”) , y se sabe que la expresión de DDH es útil para la producción de meso-DAP (documento de patente 10) . Además, se dio a conocer que, en un procedimiento de investigación de la etapa limitante de la velocidad de la biosíntesis de L-lisina en bacterias Escherichia, se introdujo un gen que codifica para DDH de bacteria corineforme en una bacteria Escherichia productora de L-lisina, en lugar de potenciar una actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP, para obtener la producción de L-lisina (documento de patente 13) . Sin embargo, no se ha esperado que, cuando se expresa DDH en una bacteria Escherichia, la disminución de una actividad de una enzima que pertenece a la ruta de síntesis de meso-DAP será eficaz para la producción de L-lisina.

Documento de patente 1: patente japonesa abierta a consulta por el público (KOKAI) n.º 10-165180

Documento de patente 2: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 11-192088

Documento de patente 3: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2000-253879

Documento de patente 4: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2001-057896

Documento de patente 5: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 2002-17363

Documento de patente 6: patente japonesa n.º 2817400 Documento de patente 7: patente japonesa abierta a consulta por el público basada en la solicitud PCT en lengua extranjera (KOHYO) n.º 2002-508921 Documento de patente 8: publicación de patente internacional WO03/008600 Documento de patente 9: solicitud publicada de patente estadounidense n.º 2003/0044943 Documento de patente 10: patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 61-289887 Documento de patente 11: publicación de patente internacional WO2006/093322 Documento de patente 12: solicitud publicada de patente estadounidense n.º 2006/0160191 Documento de patente 13: patente estadounidense n.º 6.040.160 Documento no de patente 1: Richaud, C. et al., J. Biol. Chem., 259 (23) :14824-14828, 1984 Documento no de patente 2: Heimberg, H. et al., Gene, 90 (1) : 69-78, 1990 Documento no de patente 3: Bouvier, J. et al., J. Bacteriol., 174 (16) :5265-71, 1992 Documento no de patente 4: Wiseman, J.S. et al., J. Biol. Chem., 259 (14) :8907-14, 1984

Descripción de la invención Objeto que ha de lograrse mediante la invención Un objeto de la presente invención es proporcionar una Escherichia coli que tiene capacidad productora de L-lisina mejorada y un método para producir L-lisina utilizando tal Escherichia coli.

Medios para lograr el objeto Los inventores de la presente invención realizaron diversas investigaciones con el fin de lograr el objeto mencionado anteriormente, y como resultado, encontraron que la capacidad productora de L-lisina de Escherichia coli podría mejorarse modificando Escherichia coli para disminuir la actividad de una enzima que pertenece a la ruta sintética de meso-DAP e introduciendo un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa. La presente invención se llevó a cabo partiendo de la base de este hallazgo.

Por tanto, la presente invención es tal como sigue.

(1) Una Escherichia coli que tiene una capacidad productora de L-lisina, que se ha modificado para disminuir la actividad o actividades de una o más clases de enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-, -diaminopimélico y en la que se ha introducido un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa.

(2) La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que las enzimas de la ruta de síntesis del ácido mesodiaminopimélico se seleccionan de 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa.

(3) La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato Nsucciniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa se codifican por el gen dapD, gen dapC, gen dapE y gen dapF, respectivamente.

(4) La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que las actividades de las enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-, -diaminopimélico se disminuyen mediante la disminución de la expresión de los genes o mediante la alteración de los genes.

(5) La Escherichia coli mencionada anteriormente, que se ha modificado para disminuir al menos la actividad de 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.

(6) La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que el gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa es el gen ddh de una bacteria corineforme.

(7) La Escherichia coli mencionada anteriormente, en la que la 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato Nsucciniltransferasa es una proteína definida en (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

(B) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para producir L-lisina, que comprende hacer crecer en cultivo en un medio una Escherichia coli que tiene capacidad productora de L-lisina y recoger L-lisina del medio,

en el que la Escherichia coli se ha modificado para disminuir la actividad o actividades de una o más clases de enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso-, -diaminopimélico, y

en el que se ha introducido un gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa en la Escherichia coli.

2. Método según la reivindicación 1, en el que las enzimas de la ruta de síntesis del ácido mesodiaminopimélico se seleccionan de 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa, succinildiaminopimelato transaminasa, succinildiaminopimelato desuccinilasa y diaminopimelato epimerasa se codifican por el gen dapD, gen dapC, gen dapE y gen dapF, respectivamente.

4. Método según la reivindicación 3, en el que las actividades de las enzimas de la ruta de síntesis del ácido meso

, -diaminopimélico se disminuyen mediante la disminución de la expresión de los genes o mediante la alteración de los genes.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la Escherichia coli se ha modificado para disminuir al menos la actividad de 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el gen que codifica para diaminopimelato deshidrogenasa es el gen ddh de una bacteria corineforme.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que la 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6dicarboxilato N-succiniltransferasa es una proteína definida en (A) o (B) siguientes:

(A) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,

(B) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de 2, 3, 4, 5tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que la succinildiaminopimelato transaminasa es una proteína definida en (C) o (D) siguientes:

(C) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4,

(D) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de succinildiaminopimelato transaminasa.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en el que la succinildiaminopimelato desuccinilasa es una proteína definida en (E) o (F) siguientes:

(E) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6,

(F) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de succinildiaminopimelato desuccinilasa.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en el que la diaminopimelato epimerasa es una proteína definida en (G) o (H) siguientes:

(G) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8,

(H) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de diaminopimelato epimerasa.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que el gen dapD es un ADN definido en (a) o

(b) siguientes:

(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o

(b) un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de 2, 3, 4, 5-tetrahidropiridina-2, 6-dicarboxilato N-succiniltransferasa.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en el que el gen dapC es un ADN definido en (c) o

(d) siguientes:

(c) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3, o

(d) un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de succinildiaminopimelato transaminasa.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en el que el gen dapE es un ADN definido en (e) o

(f) siguientes:

(e) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5, o

(f) un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de succinildiaminopimelato desuccinilasa.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, en el que el gen dapF es un ADN definido en (g) o

(h) siguientes:

(g) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, o

(h) un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de diaminopimelato epimerasa.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la diaminopimelato deshidrogenasa es una proteína definida en (I) o (J) siguientes:

(I) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 ó 18,

(J) una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16 ó 18 que incluye sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de uno o varios residuos de aminoácidos y que tiene la actividad de diaminopimelato deshidrogenasa.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que el gen ddh es un ADN definido en (i) o (j) siguientes:

(i) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 ó 17, o

(j) un ADN que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 ó 17 o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos en condiciones rigurosas y que codifica para una proteína que tiene la actividad de diaminopimelato deshidrogenasa.

17. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la Escherichia coli tiene además una dihidrodipicolinato sintasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina y una aspartocinasa que está desensibilizada para la retroinhibición por L-lisina y tiene actividad potenciada de dihidrodipicolinato reductasa.


 

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