Método para la síntesis química de polipéptidos y proteínas.

Un método para formar un enlace amida entre una primera molécula que tiene un resto tioéster y una segundamolécula que tiene un residuo N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO:

1) con un residuo sulfhidrilo no oxidado, quecomprende las etapas de:

(a) hacer reaccionar dicho resto tioéster de la primera molécula con dicho resto sulfhidrilo no oxidado delresiduo N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO: 1) de la segunda molécula para generar un compuesto intermedioque conecta las primera y segunda moléculas con un enlace ß-(amino C1-C5)-tioéster; y

(b) permitir que el enlace ß-(amino C1-C5)-tioéster del compuesto intermedio se re-dispongaintramolecularmente para formar un enlace amida que conecta dichas primera y segunda moléculas.

Método para la síntesis química de polipéptidos y proteínas

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a métodos y compuestos intermedios para la síntesis química de polipéptidos y

proteínas y, más particularmente, a métodos y compuestos intermedios para ligar químicamente un fragmento de péptido que contiene N-metil-cisteína N-terminal (SEQ ID NO: 1) con otro fragmento de péptido que tiene un tioéster C-terminal, para generar un compuesto intermedio de β- (metilamino) -tioéster que se re-dispone espontáneamente para formar un enlace amida. Además, la invención se refiere a métodos de convertir N-metil-tiazolidina en N-metilcisteína (SEQ ID NO: 1) de polipéptidos y proteínas.

Se han desarrollado varias técnicas para sintetizar quimicamente proteínas. Véase, p. ej., Stewart, J. M. et al., Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., 2ª ed., 1984) y Bodanszky, M. et al., The Practice of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, 1984) . Entre ellas, el ligamiento químico nativo ha demostrado ser uno de los métodos más útiles para generar químicamente proteínas nativas. Sin embargo, el ligamiento químico nativo es sólo adecuado para la síntesis de polipéptidos y proteínas con residuo (s) cisteína, que se pueden utilizar como el o los puntos de conexión para ligar fragmentos de péptidos para formar los polipéptidos y proteínas dianas finales.

Para producir análogos y derivados de polipéptidos y proteínas que tengan propiedades químicas y biológicas mejoradas se requiere a veces la incorporación de residuo (s) aminoácidos no naturales en posición o posiciones específicas dentro de los polipéptidos y proteínas. Análogos y derivados de este tipo pueden tener estabilidad química mejorada, estabilidad enzimática mejorada, prolongada duración de la acción in vivo y actividades 20 biológicas mejoradas. Una clase de aminoácidos no naturales de este tipo son los N-metil-aminoácidos. Los N-metilaminoácidos pueden imponer una limitación conformacional a la cadena principal del péptido, bloquear sitios de unión de hidrógeno y proteger potencialmente los enlaces péptido frente a la escisión enzimática (véase, p. ej., Haviv, F. et al., J. Med. Chem., 1993, 36:363-369; Failie, D.P., et al., Curr. Med. Chem., 1995, 2:654-686; Miller, S.M., et al., Drug Dev. Res., 1995, 35:20-32; y Schmidt, R., et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1995, 46:47-55) . N-metil

cisteína (SEQ ID NO: 1) es un miembro de esta clase de aminoácidos no naturales. Para generar análogos y derivados de proteínas biológicamente más activos y enzimáticamente más estables, existe la necesidad de desarrollar un nuevo método químico para incorporar un residuo N-metil-cisteína (SEQ ID NO: 1) en cualquier posición deseada dentro de las proteínas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es una ilustración que muestra un esquema de síntesis para formar un enlace amida de acuerdo con un aspecto de la presente invención.

La FIG. 2 es una ilustración que muestra un esquema de síntesis para proteger N-meti-cisteína N-terminal (SEQ ID NO: 1) en una forma de N-metil-tiazolidina durante la síntesis química de polipéptidos y proteínas de acuerdo con un aspecto de la presente invención.

La FIG. 3 es una ilustración que muestra un esquema de síntesis para sintetizar un péptido-tioéster a partir de un péptido-ácido protegido.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está dirigida a un método para formar un enlace amida entre dos moléculas que pueden ser proteínas, polipéptidos, peptidomiméticos, polímeros o cualquier combinación de los mismos. Entre estas dos 40 moléculas, una -la "primera" -molécula contiene un residuo HN-metil-cisteína (o simplemente, "N-metil-cisteína" (SEQ ID NO: 1) ) terminal y la otra -la "segunda" - molécula contiene un grupo funcional tioéster. Durante la reacción, las dos moléculas se conectan primero a través de un enlace β- (metilamino) -tioéster, y luego el enlace β (metilamino) -tioéster se convierte espontáneamente en el enlace amida final a través de una re-disposición intramolecular, tal como se muestra en la FIG. 1. El producto final resultante contiene los restos de las dos 45 moléculas que están conectadas a través del enlace amida recién formado.

Otro aspecto de la presente invención está dirigido a una reacción de ligamiento que se lleva a cabo en disolución o en fase sólida. El medio de reacción puede contener catalizador o catalizadores de tiol. Catalizadores de tiol de este tipo incluyen, pero no se limitan a tiofenol, 1-tio-2-nitrofenol, ácido 2-tio-benzoico, 2-tio-piridina, ácido 4-tio-2piridinacarboxílico, 4-tio-2-nitropiridina, ácido 4-mercaptofenilacético, ácido 2-mercaptoetanosulfónico, ácido 3

mercapto-1-propanosulfónico y ácido 2, 3-dimercaptopropanosulfónico.

Otro aspecto de la presente invención está dirigido a la conversión de N-metil-tiazolidina en N-metil-cisteína (SEQ ID NO: 1) . Para este ligamiento escalonado se necesita un fragmento de péptido que porte N-metil-cisteína N-terminal (SEQ ID NO: 1) y tioéster C-terminal. Sin embargo, los grupos tio-protectores convencionales tales como bencilo para la química Boc, y tritilo y t-butilo para la química Fmoc, no se pueden utilizar para proteger el grupo sulfhidrilo 55 de la N-metil-cisteína N-terminal (SEQ ID NO: 1) . Esto es debido al hecho de que durante la etapa de escisión final

se separará un grupo protector convencional de este tipo y se generará un grupo sulfhidrilo libre, el cual reaccionará con el tioéster C-terminal para formar productos indeseados.

Para acometer este problema, la presente invención proporciona un método para proteger N-metil-cisteína Nterminal (SEQ ID NO: 1) en una forma de N-metil-tiazolidina durante la síntesis química de polipéptidos y proteínas, 5 tal como se muestra en la FIG. 2. La N-metil-tiazolidina permanecerá intacta durante la etapa de escisión y se generará un compuesto intermedio peptídico que contiene N-metil-tiazolidina N-terminal y tioéster C-terminal. Este compuesto intermedio se utilizará en la reacción de ligamiento con otro fragmento de péptido que contiene tioéster C-terminal. Sólo después de la reacción de ligamiento, la N-metil-tiazolidina en el producto se convertirá en una Nmetil-cisteína libre (SEQ ID NO: 1) utilizando una agente nucleofílico bajo condiciones de carácter ácido, en donde dicho agente nucleofílico es O-alquilhidroxilamina y, más específicamente, en donde dicha O-alquilhidroxilamina es O-metilhidroxilamina, y en donde dichas condiciones de carácter ácido se encuentran en el intervalo de pH 2, 0 a pH 6, 0. El fragmento de péptido mayor resultante con un residuo N-metil-cisteína N-terminal (SEQ ID NO: 1) se puede utilizar para una etapa de ligamiento adicional utilizada para generar polipéptidos o proteínas incluso mayores.

Resultará evidente para un experto en la técnica que se pueden utilizar otros reaccionantes y compuestos 15 intermedios que incluyen, pero no se limitan a N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO: 1) , N-tiazolidina (C1-C5) , β- (amino C1C5) -tioéster, y similares.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un método para formar un enlace amida entre una primera molécula que tiene un resto tioéster y una segunda molécula que tiene un residuo N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO: 1) con un resto sulfhidrilo no oxidado, que comprende las etapas de:

(a) hacer reaccionar dicho resto tioéster de la primera molécula con dicho resto sulfhidrilo no oxidado del residuo N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO: 1) de la segunda molécula para generar un compuesto intermedio que conecta las primera y segunda moléculas con un enlace β- (amino C1-C5) -tioéster; y

(b) permitir que el enlace β- (amino C1-C5) -tioéster del compuesto intermedio se re-disponga intramolecularmente para formar un enlace amida que conecta dichas primera y segunda moléculas.

La invención proporciona también un método para sintetizar un polipéptido o una proteína mediante ligamiento de dos fragmentos de péptido, que comprende las etapas de:

(a) formar un enlace amida mediante ligamiento de un tioéster C-terminal del primer fragmento de péptido que contiene N-tiazolidina (C1-C5) N-terminal con una N-cisteína (C1-C5) N-terminal (SEQ ID NO: 1) del segundo fragmento de péptido; y

(b) tratar el producto de ligamiento con un agente nucleofílico bajo condiciones de carácter ácido para convertir el residuo N-tiazolidina (C1-C5) N-terminal en el residuo N-cisteína (C1-C5) N-terminal (SEQ ID NO: 1) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Determinados aminoácidos... [Seguir leyendo]

Un método para formar un enlace amida entre una primera molécula que tiene un resto tioéster y una segunda molécula que tiene un residuo N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO: 1) con un residuo sulfhidrilo no oxidado, que comprende las etapas de:

(a) hacer reaccionar dicho resto tioéster de la primera molécula con dicho resto sulfhidrilo no oxidado del residuo N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO: 1) de la segunda molécula para generar un compuesto intermedio que conecta las primera y segunda moléculas con un enlace β- (amino C1-C5) -tioéster; y

(b) permitir que el enlace β- (amino C1-C5) -tioéster del compuesto intermedio se re-disponga intramolecularmente para formar un enlace amida que conecta dichas primera y segunda moléculas.

2. El método según la reivindicación 1, en el que: dicho residuo N-cisteína (C1-C5) (SEQ ID NO: 1) es un residuo N-metil-cisteína (SEQ ID NO: 1) ; y/o dicho enlace β- (amino C1-C5) -tioéster es un enlace β- (metilamino) -tioéster; y/o dichas primera y segunda moléculas se seleccionan independientemente de un grupo que incluye fragmentos peptídicos, polipéptidos, peptidomiméticos y proteínas; y/o 15 dicha reacción y etapas de re-disposición tienen lugar en una disolución o en una fase sólida; y dicha etapa de reacción tiene lugar en presencia de al menos un catalizador de tiol.

3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho catalizador de tiol se selecciona del grupo que consiste en tiofenol, 1-tio-2-nitrofenol, ácido 2-tio-benzoico, 2-tio-piridina, ácido 4-tio-2-piridinacarboxílico, 4-tio-2-nitropiridina, ácido 4-mercaptofenilacético, ácido 2-mercaptoetanosulfónico, ácido 3-mercapto-1-propanosulfónico y ácido 2, 3

dimercaptopropanosulfónico.

Un método para sintetizar un polipéptido o una proteína mediante ligamiento de dos fragmentos de péptido, que comprende las etapas de:

(a) formar un enlace amida mediante ligamiento de un tioéster C-terminal del primer fragmento de péptido que contiene N-tiazolidina (C1-C5) N-terminal con una N-cisteína (C1-C5) N-terminal (SEQ ID NO: 1) del segundo 25 fragmento de péptido; y

(b) tratar el producto de ligamiento con un agente nucleofílico bajo condiciones de carácter ácido para convertir el residuo N-tiazolidina (C1-C5) N-terminal en el residuo N-cisteína (C1-C5) N-terminal (SEQ ID NO: 1) .

5. El método según la reivindicación 4, en el que: dicho agente nucleofílico es O-alquilhidroxilamina;

dichas condiciones ácidas están en el intervalo de pH 2, 0 a pH 6, 0; y dichas etapa (a) y etapa (b) se pueden repetir hasta formar un polipéptido o proteína deseado.

6. El método según la reivindicación 5, en el que dicha O-alquilhidroxilamina es O-metilhidroxilamina.