Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes), antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos.

Proteína de fusión que tiene la siguiente estructura: **Tabla**

Método para la producción de anticuerpos catalíticos (variantes) , antígenos para inmunización y secuencia de nucleótidos.

Campo de la invención La presente invención se relaciona con biotecnología, inmunología, ingeniería genética, las industrias microbiológicas y medicinales y comprende un enfoque combinado para la fabricación y la expresión de anticuerpos catalíticamente activos que son terapéuticos potenciales destinados a destruir antígenos de proteína, en particular, la gp120, que es la principal proteína de superficie del virus de inmunodeficiencia humana.

Estado de la técnica

Se sabe que se pueden diseñar anticuerpos catalíticos dirigidos a las sustancias fisiológicamente activas y a objetos naturales útiles en biomedicina como representaciones específicas de los estados de transición de conversiones químicas modeladas. La patente de los Estados Unidos No. 5.948.658 da a conocer un anticuerpo diseñado por el enfoque anterior y capaz de escindir específicamente al narcótico cocaína. A pesar de una tecnología altamente desarrollada para la producción de anticuerpos monoclonales, este enfoque no puede ser efectivo en el caso de biopolímeros, proteínas y péptidos de elevado peso molecular debido a que es difícil modelar los correspondientes estados de transición de la reacción.

La producción de anticuerpos catalíticos activos directamente contra la gp120 se da a conocer en el documento WO 9703696; sin embargo, de acuerdo con el documento WO 9703696, se obtiene el anticuerpo a partir del suero del paciente, lo que impide el desarrollo de una tecnología médica unificada para la producción de un medicamento.

Resumen de la invención La proteína de fusión de la invención tiene la siguiente estructura:

El objetivo de la presente invención es desarrollar un método para producir anticuerpos catalíticos contra proteínas y péptidos, en particular la gp120, con el uso de animales con patologías autoinmunes espontáneas e inducibles,

donde dicho método hará posible el diseño de una "vacuna catalítica" que, después de ser inyectada a un paciente, es capaz no sólo de enlazarse con el antígeno, sino también de destruirlo inhibiendo así el desarrollo de la enfermedad.

Se proporciona un método para la producción de anticuerpos catalíticos con el uso de animales con patologías autoinmunes espontáneas e inducidas. Se utilizan ratones como los animales con patologías autoinmunes espontáneas e inducibles. Los ratones usados pertenecen a cepas para las que la inmunización con proteína básica de mielina o su fragmento puede inducir el desarrollo de encefalomielitis autoinmune experimental. A los animales se les administra una proteína de fusión que consta de la proteína básica de mielina o de sus fragmentos y un sustrato potencial de anticuerpo catalítico o un fragmento del sustrato potencial. El sustrato potencial es la gp120 (glicoproteína de superficie del VIH-1) o sus fragmentos.

Se proporciona una proteína de fusión que tiene la siguiente estructura: Se propone una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión de la estructura anterior.

Se proporciona un método para la producción de un anticuerpo catalítico utilizando animales con patologías autoinmunes espontáneas e inducidas. El animal con patologías autoinmunes espontáneas e inducibles son ratones MRL-lpr/lpr, siendo los ratones inmunizados con un antígeno que contiene un hapteno, siendo el hapteno un conjugado de un inhibidor de la proteasa covalente que depende de un mecanismo con un péptido, siendo el péptido un fragmento de un sustrato potencial del anticuerpo catalítico.

El sustrato potencial del anticuerpo catalítico es gp120 o su fragmento.

El peptidilfosfonato tiene la siguiente estructura:

Breve descripción de los dibujos:

Figura 1. Secuencia de nucleótidos del fragmento I-III de gp120. Los fragmentos I, II y III, están coloreados de forma secuencial. Los cebadores utilizados en la PCR se señalan con letras mayúsculas.

Figura 2. Diagramas de proteínas recombinantes obtenidas con el uso del vector pET32b.

Figura 3. Diagramas de proteínas recombinantes obtenidas con el uso del vector pET28a.

Figura 4. Electroforetograma (A) e inmunotransferencia (B) de las diferentes etapas de aislamiento y purificación de la proteína gp120I-IIImbp (el producto del constructo 15) . 1 - proteínas celulares totales antes de la inducción; 2 proteínas celulares totales después de la inducción; 3 - la fracción de proteínas intracelulares solubles; 4 - proteínas solubles no retenidas por la columna quelante de metal; 5 -proteínas solubles eluidas a pH 5, 0; 6 - preparación de una forma de proteína soluble después de purificación cromatográfica; 7 - la fracción de proteínas intracelulares insolubles; 8 - proteínas insolubles no retenidas por la columna quelante de metales; 9 - preparación de una forma de proteína desnaturalizada después de purificación cromatográfica; 10 - marcador.

Figura 5. Análisis de la especificidad antigénica de anticuerpos en suero de ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp con diferentes dosis. La leyenda de la figura indica la dosis de inmunógeno; SJL-2 son ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón, SJL-3 son ratones inmunizados con la dosis de 300 µg por ratón.

Figura 6. Los principios de análisis de fluorescencia y enzimáticos de la actividad proteolítica.

Figura 7. Determinación de la actividad proteolítica de la preparación de anticuerpos aislados a partir de suero de ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp. SJL-1 son los ratones de control. SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón. SJL-3 son los ratones inmunizados con la dosis de 300 µg por ratón. BSA-FITC y gp120-FITC se utilizaron como sustratos.

Figura 8. Inhibición de la actividad proteolítica de la preparación de anticuerpos aislados a partir de suero de ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp. SJL-1 son los ratones de control.

SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón.

AEBSF: fluoruro de aminoetanobencenosulfonilo.

CMC: fenilalanilclorometilcetona.

Figura 9. Inhibición de anticuerpos antiespecie de la actividad proteolítica de la preparación de anticuerpos aislados a partir de suero de ratones SJL inmunizados con gp120I-IIImbp. SJL-1 son los ratones de control. SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón.

Anti-IgG: anticuerpos policlonales de conejo contra IgG de múrido.

Figura 10. Determinación enzimática de la actividad proteolítica de preparaciones de anticuerpos aislados a partir de sueros de ratones SJL inmunizados con las proteínas de fusión gp120I-IIImbp a diferentes dosis. A: SJL-1 son los ratones de control; SJL-2 son los ratones inmunizados con la dosis de 150 µg por ratón; SJL-3 son los ratones inmunizados con la dosis de 300 µg por ratón; CBA son ratones de control CBA.

Figura 11. Los cambios en el nivel de expresión de marcadores de superficie de las células T del sistema inmune de los ratones SJL inmunizados con la proteína de fusión gp120I-IIImbp a diferentes dosis, con la proteína recombinante gp120I-III, y con el péptido encefalitogénico MBP89-104. SJL-1 son los ratones no inmunizados. SJL-2 son los ratones inmunizados con gp120I-IIImbp con la dosis de 150 µg por ratón. SJL-3: ratones inmunizados con gp120I-IIImbp con la dosis de 300 µg por ratón. SJL-4 son ratones inmunizados con el péptido MBP89-104. SJL-5 son los ratones inmunizados con la proteína recombinante gp120I-III con la dosis de 300 µg por ratón.

Figura 12. Inmunoensayo enzimático de los sueros de ratones SJL, MRL-lpr/lpr y NZB/NZW F1 inmunizados con peptidilfosfonato. El antígeno utilizado fue: A - péptido reactivo biotinilado; B - difenilvalilfosfonato biotinilado; C metil p-nitrofenil biotinilfenilmetilfosfonato.

Figura 13. Electroforetograma (A) e inmunotransferencia (B) de anticuerpos policlonales aislados de los ratones inmunizados de cepas de ratones SJL (4) , MRL-lpr/lpr (5) y NZB/NZW F1 (6) y modificados covalentemente con un antígeno. Carriles 1 - 3: 10 µg de BSA, 1 µg de tripsina, y 1 µg de IgG de ratones BALB/c.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos:

Ejemplo 1. Desarrollo de un constructo genético que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión gp120I-IIImbp para su expresión en un sistema procariota.

1) Para inducir la encefalomielitis autoinmune (EAE) en ratones SJL, se escogió el péptido 89 - 104 de la proteína... [Seguir leyendo]