Método para la preparación de virus y proteínas del PRRS, y kits de pruebas de diagnóstico para su detección.

Un método para la preparación de una composición vacunal que contiene proteínas y antígenos del virus delPRRS a partir de células infectadas por el virus PRRS,

comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar una población de células infectada con el virus del PRRS;

(b) separar dichas células infectadas del virus del PRRS libre de células para formar células aisladas quecontengan proteínas y antígenos del virus del PRRS asociadas con las células; y

(c) extraer o eluir proteínas y antígenos del virus del PRRS de las células aisladas con una solución quecontenga detergente para producir una preparación que comprenda proteínas y antígenos del virus del PRRS;y

(d) combinar dicho extracto o eluido con un adyuvante para formar una composición vacunal.

Método para la preparación de virus y proteínas del PRRS, y kits de pruebas de diagnóstico para su detección Campo de la invención La presente invención se refiere a dispositivos y a métodos para la detección de anticuerpos que reconocen una o más proteínas y/o antígenos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) . Los anticuerpos pueden estar en un fluido biológico de un sujeto infectado o en riesgo de infectarse con el PRRSV. La invención se puede aplicar ventajosamente tanto al diagnóstico como a la prevención de la infección por PRRSV.

Antecedentes de la invención Una de las principales causas de pérdidas económicas en la industria porcina de EE.UU. es el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) o PRRSV. El PRRSV es el agente causante de problemas de reproducción y trastornos respiratorios en cerdos. Las pérdidas económicas asociadas con el PRRS se deben principalmente a su implicación en el aborto de hembras preñadas y en el complejo respiratorio porcino (CRP) en cerdos en crecimiento. Se han puesto en práctica diferentes medidas de control, incluyendo el uso de una vacuna y cambios en la gestión. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.690.940. Sin embargo, a pesar de la vacunación rutinaria, los brotes del PRRSV en las granjas de cerdos son frecuentes.

Los brotes se deben más comúnmente a la falta de medidas en materia de bioseguridad. La baja detección de cerdas jóvenes de reposición infectadas con el PRRSV en las piaras ha sido una causa común de deficiencias en bioseguridad. Estos problemas se podrían evitar si las granjas contaran con un método sencillo y económico para analizar la infección por PRRSV. Dicho método también se puede aplicar para comprobar si las cerdas están produciendo lechones destetados negativos y durante los procedimientos de aclimatación.

Para analizar los anticuerpos contra el PRRSV, los veterinarios deben recoger muestras de sangre y enviarlas a un laboratorio de diagnóstico veterinario. En la actualidad, el ELISA, la prueba de inmunofluorescencia indirecta y el ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa son métodos comunes de laboratorio para la detección de anticuerpos contra el PRRSV. Sin embargo, estos métodos requieren equipos costosos y técnicas de laboratorio cualificadas. Para el uso de estas técnicas, se requieren al menos 3 días, incluyendo el tiempo del envío por correo, para obtener un resultado. Además, los productores de cerdos tienen que incurrir en gastos para la recogida de las muestras y su envío a un laboratorio de diagnóstico. Una prueba de campo sencilla y rápida para la detección de anticuerpos contra el PRRSV sería muy útil en los laboratorios de las clínicas veterinarias o granjas porcinas. En general, la erradicación de la enfermedad con una vacuna contra el PRRSV no ha sido satisfactoria a nivel agropecuario. Los métodos tales como la despoblación total y la repoblación han demostrado ser eficaces para la erradicación en la granja. Sin embargo, tales métodos no se pueden usar en todas las granjas y son relativamente caros de realizar.

Por otra parte, dichos métodos dependen de la detección del PRRSV. Se han descrito las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas codificadas de algunas cepas del PRRSV. La detección del PRRSV a través de muestras de tejido, incluyendo el tejido pulmonar, también se ha tratado (véase el documento WO 96/06619) , lo que coincide con la observación de que el PRRSV se replica preferentemente en los macrófagos alveolares del pulmón. Tras la infección por vía oronasal, el PRRSV replicado en los macrófagos pulmonares continúa hasta los ganglios linfáticos pulmonares y luego hasta los diferentes órganos por el torrente sanguíneo.

La mención de los documentos en la presente memoria no pretende indicar que alguno de ellos sea técnica anterior pertinente. Todas las afirmaciones con respecto a la fecha o representación en cuanto al contenido de los documentos se basan en la información disponible para el solicitante y no constituyen admisión alguna en cuanto a la exactitud de las fechas o el contenido de los documentos.

Breve resumen de la invención La presente invención proporciona un método para la preparación de una composición vacunal que contiene proteínas y antígenos del virus del PRRS de células infectadas con el virus PRRS, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar una población de células infectada con el virus del PRRS;

(b) separar dichas células infectadas del virus del PRRS libre de células para formar células aisladas que contengan proteínas y antígenos del virus del PRRS asociadas con las células; y

(c) extraer o eluir las proteínas y los antígenos del virus del PRRS de las células aisladas con una solución que contenga detergente para producir una preparación que comprenda proteínas y antígenos del virus del PRRS; y

(d) combinar dicho extracto o eluido con un adyuvante para formar una composición vacunal.

La presente invención también se refiere a dispositivos y métodos para la detección de la infección de un sujeto por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) o PRRSV. La detección se realiza mediante el uso

de composiciones que contienen una o más proteínas y/o antígenos codificados por el PRRSV que se unen a anticuerpos contra dichas proteínas. Por lo tanto, la invención se puede considerar como aquella basada en el principio de "captura de anticuerpos" seguida de la detección de los anticuerpos. Los anticuerpos son los que están presentes en un sujeto infectado con el PRRSV, pero ausentes en individuos no infectados.

La una o más proteínas codificadas por el virus del PRRS pueden incluir la proteína de la nucleocápside (N) y/o una o más proteínas de la envoltura viral ("E") . Las proteínas también pueden ser glucoproteínas que se encuentran en la superficie de las células infectadas por el PRRSV. Las proteínas también se pueden considerar antígenos del PRRSV usados contra anticuerpos detectados en un sujeto, donde los anticuerpos reconocen las proteínas del PRRSV y, por lo tanto, el PRRSV.

La/s proteína/s y/o los antígenos del PRRSV se pueden usar ventajosamente en kits, dispositivos y métodos para detectar la infección por PRRSV en los primeros momentos, en base a la detección de anticuerpos contra el PRRSV. Dichos métodos de detección se basan en la presencia de anticuerpos, en un sujeto infectado poco tiempo después de la infección, contra al menos una proteína y/o antígenos del PRRSV según lo descrito en la presente memoria.

Las composiciones que contienen una o más proteínas y/o antígenos expresados por el PRRSV se pueden usar en la preparación o el uso de un kit o dispositivo según lo descrito en la presente memoria. El dispositivo puede ser una placa que está revestida de una composición descrita en la presente memoria. Los ejemplos no restrictivos de dichas placas incluyen placas de Petri de varios tamaños, así como los pocillos de una placa de microtitulación. La placa se puede usar en una prueba de diagnóstico para los anticuerpos contra una o más proteínas y/o antígenos del PRRSV contenidos en la composición. Por lo tanto, dichos dispositivos se pueden usar para detectar la presencia de anticuerpos contra una o más proteínas y/o antígenos del PRRSV en la composición. Los anticuerpos que se van a detectar pueden estar en una muestra de un fluido biológico, y si los anticuerpos están presentes, sirven como indicador de la infección por PRRSV en el sujeto del que se tomó la muestra. Así pues, los dispositivos se pueden usar como un medio rápido de diagnóstico de la presencia de infección por PRRSV.

En el centro de dicho dispositivo hay una forma inmovilizada de una o más proteínas y/o antígenos del PRRSV presentes en la composición. Una proteína y/o un antígeno del PRRSV se puede inmovilizar directamente, tal como por adsorción (por ejemplo, revestimiento) o por conjugación a una superficie de un dispositivo como ejemplos no restrictivos. Como alternativa, la proteína y/o el antígeno se pueden inmovilizar indirectamente, tal como mediante el uso de un agente que se una a la proteína y/o al antígeno o mediante el uso de un ligador que se una tanto a la superficie como a la proteína o al antígeno. Por lo tanto, la/s proteína/s y/o el/los antígeno/s inmovilizado/s del PRRSV se pueden considerar un "agente de captura" para la unión por un anticuerpo contra la/s proteína/s y/o el/los antígeno/s para formar un complejo inmovilizado que contenga la/s proteína/s y/o el/los antígeno/s. El "agente de captura" inmovilizado se puede considerar, por supuesto, un agente para "capturar" un anticuerpo que se una al... [Seguir leyendo]

1. Un método para la preparación de una composición vacunal que contiene proteínas y antígenos del virus del PRRS a partir de células infectadas por el virus PRRS, comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar una población de células infectada con el virus del PRRS;

(b) separar dichas células infectadas del virus del PRRS libre de células para formar células aisladas que contengan proteínas y antígenos del virus del PRRS asociadas con las células; y

(c) extraer o eluir proteínas y antígenos del virus del PRRS de las células aisladas con una solución que contenga detergente para producir una preparación que comprenda proteínas y antígenos del virus del PRRS; y

(d) combinar dicho extracto o eluido con un adyuvante para formar una composición vacunal.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha población de células ha sido infectada con el virus del PRRS durante un tiempo suficiente para producir una dosis infecciosa de cultivo de tejidos (TCID) 50/ml inferior a 1015 del sobrenadante.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicha población de células ha sido infectada con el virus del PRRS durante un tiempo suficiente para observarse CPE en una etapa temprana.

4. El método de la reivindicación 1 o 2, donde dicha solución que contiene detergente contiene Triton X-100 al 0, 5%.

5. El método de la reivindicación 1, 2, 3 o 4, donde dicha extracción o elución se realiza durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 15 horas a 4 ºC.

6. El método de la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5, donde dichas proteínas y antígenos incluyen proteínas de la envoltura

o la proteína N del virus del PRRS.

7. Un método basado en el ensayo enzimático de inmunodifusión vertical (VIDEA) , comprendiendo dicho método:

(a) proporcionar un dispositivo de diagnóstico que comprende al menos una superficie revestida con una o más proteínas y antígenos del virus del PRSS preparados mediante:

(i) el suministro de una población de células infectadas con el virus del PRRS;

(ii) la separación de dichas células infectadas del virus del PRRS libre de células para formar células aisladas que contengan proteínas y antígenos del virus del PRRS asociados con las células; y

(iii) la extracción o elución de las proteínas y los antígenos del virus del PRRS de las células aisladas con una solución que contenga detergente habiendo sido dicha superficie recubierta con una capa de agar o agarosa sobre dicha al menos una superficie;

(b) poner en contacto la superficie de agar o agarosa con un material poroso que comprenda una muestra que contenga anticuerpos obtenida de un sujeto;

(c) incubar dicho dispositivo durante un período suficiente para permitir la difusión del material de dicha muestra a dicha uno o más superficies, teniendo lugar dicho período opcionalmente después de retirar el material poroso; y

(d) detectar la presencia de anticuerpos en la superficie de la placa tras retirar el agar o la agarosa.

8. El método de la reivindicación 7, donde dicha muestra es una muestra de suero o una muestra de sangre entera.

9. El método de la reivindicación 7 o 8, donde dicho material poroso es un disco de papel.

10. El método de la reivindicación 7 o 8, donde dicho sujeto es sospechoso de estar infectado con el virus del PRRS.

11. Un método basado en el ensayo enzimático de inmunodifusión horizontal (HIDEA) , comprendiendo dicho método:

a) proporcionar un dispositivo de diagnóstico que comprende al menos una superficie revestida con una o más proteínas y antígenos del virus del PRSS preparados mediante

(i) el suministro de una población de células infectadas con el virus del PRRS;

(ii) la separación de dichas células infectadas del virus del PRRS libre de células para formar células aisladas que contengan proteínas y antígenos del virus del PRRS asociados con las células; y

(iii) la extracción o elución de las proteínas y los antígenos del virus del PRRS de las células aisladas con una solución que contenga detergente; habiendo sido dicha superficie recubierta con una capa de agar o agarosa que comprende una o más hendiduras para recibir la muestra sobre dicha al menos una superficie;

(b) poner en contacto la una o más hendiduras con una muestra que contenga anticuerpos obtenida de un sujeto;

(c) incubar dicho dispositivo durante un período suficiente para permitir la difusión del material de dicha

muestra a dicha uno o más superficies; y 5 (d) detectar la presencia de anticuerpos en la superficie de la placa tras retirar el agar o la agarosa.

12. El método de la reivindicación 7 o 11, donde dicho dispositivo es una placa.

13. El método de la reivindicación 1, donde dicha solución que contiene detergente contiene detergente no iónico. 10