Descelularización y recelularización de órganos y tejidos.

Un método ex vivo de descelularización de un órgano de mamífero o un tejido vascularizado de mamífero,

que comprende:

proporcionar un órgano de mamífero que posee una matriz extracelular y un lecho vascular sustancialmente cerrado y células integradas en la matriz extracelular, o proporcionar un tejido vascularizado de mamífero que tiene una matriz extracelular y un árbol vascular y células integradas en la matriz extracelular;

canular dicho órgano o tejido en uno o más vasos y/o conductos, produciendo así un órgano o tejido canulado; y

perfundir la vasculatura de dicho órgano o tejido vascularizado canulado con un primer medio de disrupción celular, a través de dichas una o más canulaciones.

Descelularización y recelularización de órganos y tejidos

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a órganos y tejidos, y más concretamente a los métodos y materiales para descelularizar y recelularizar órganos y tejidos.

ANTECEDENTES

Se han desarrollado matrices obtenidas biológicamente para la ingeniería y regeneración tisular. No obstante, las matrices desarrolladas hasta la fecha tienen generalmente una estructura de matriz comprometida y/o no presentan un lecho vascular que permita la reconstitución efectiva del órgano o tejido. Esta divulgación describe métodos para la descelularización y recelularización de órganos y tejidos. WO03/043674 D5 divulga un órgano y un método para producir un órgano mediante perfusión de un órgano descelularizado con una población de células endoteliales.

RESUMEN

La presente invención se define por las reivindicaciones. La invención proporciona métodos para descelularizar un órgano o tejido, así como métodos para recelularizar un órgano o tejido descelularizado.

En un aspecto, la invención proporciona un corazón de mamífero descelularizado. Un corazón de mamífero descelularizado incluye una matriz extracelular descelularizada del corazón que tiene una superficie exterior. La matriz extracelular de un corazón descelularizado conserva sustancialmente la morfología de la matriz extracelular previa a la descelularización, y la superficie exterior de la matriz extracelular se encuentra sustancialmente intacta.

Algunos corazones representativos incluyen, a título meramente enunciativo, corazones de roedor, de cerdo, de conejo, de vacuno, de oveja o de canino. Otro corazón representativo es un corazón humano. El corazón descelularizado puede ser cadavérico. En alguna realización, el corazón descelularizado es una porción de un corazón entero. Por ejemplo, una porción de un corazón entero puede incluir, a título meramente enunciativo, un parche cardiaco, una válvula aórtica, una válvula mitral, una válvula pulmonar, una válvula tricúspide, un atrio derecho, un atrio izquierdo, un ventrículo derecho, un ventrículo izquierdo, un septo, una vasculatura coronaria, una arteria pulmonar o una vena pulmonar.

En otro aspecto, la invención proporciona un órgano sólido. Conforme a la descripción del presente, un órgano sólido incluye el corazón descelularizado anteriormente descrito y una población de células regenerativas unidas al mismo. En determinadas realizaciones, las células regenerativas son células pluripotentes. En algunas realizaciones, las células regenerativas son células madre embriónicas, células del cordón umbilical, células progenitoras o células madre obtenidas de adultos, células obtenidas de la médula espinal, células obtenidas de la sangre, células madre mesenquimales (MSC) , células obtenidas de músculo esquelético, células progenitoras adultas multipotentes (MAPC) , células madre cardíacas (CSC) o células madre adultas multipotentes obtenidas del corazón de origen no humano. En algunas realizaciones, las células regenerativas son fibroblastos cardíacos, células de la microvasculatura cardiaca o células endoteliales aórticas.

Por lo general, el número de células regenerativas unidas al corazón descelularizado son al menos unas 1.000. En algunas realizaciones, el número de células regenerativas unidas al corazón descelularizado es de unas 1.000 células/mg de tejido (peso en fresco, es decir, peso antes de la descelularización) a unos 10.000.000 de células/mg de tejido (peso en fresco) . En algunas realizaciones, las células regenerativas son heterólogas a la parte descelularizada. Asimismo, en algunas realizaciones, el órgano sólido va a ser trasplantado a un paciente y las células regenerativas son autólogas al paciente.

En otro aspecto más, la invención proporciona un método ex vivo para hacer un órgano sólido. Por lo general, este método incluye proporcionar un corazón descelularizado como el descrito en el presente y poner en contacto el corazón descelularizado con una población de células regenerativas en condiciones en las que las células regenerativas se injertan, se multiplican y /o se diferencian dentro del corazón descelularizado y sobre el mismo. En una realización, las células regenerativas son inyectadas y perfundidas en el corazón descelularizado.

En otro aspecto más, la invención proporciona un método ex vivo para la descelularización de un corazón. Este método incluye proporcionar un corazón, canular el corazón en una o más cavidades, vasos y/o conductos para producir un corazón canulado, y perfundir el corazón canulado con un primer medio de disrupción celular a través de la canulación o canulaciones. Por ejemplo, la perfusión puede ser multidireccional desde cada cavidad, vaso y/o conducto canulado. Típicamente, el medio de disrupción celular comprende al menos un detergente, como SDS, PEG o Triton X.

Este método puede incluir también la perfusión del corazón canulado con un segundo medio de disrupción celular a través de las canulaciones. Por lo general, el primer medio de disrupción celular puede ser un detergente aniónico, como SDS, y el segundo medio de disrupción celular puede ser un detergente iónico, como Triton X. En estos métodos, la perfusión puede extenderse durante unas 2 a 12 horas por gramo (peso en fresco) de tejido cardiaco.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente tienen el significado que normalmente entiende una persona con conocimientos en el campo al que pertenece la presente invención. A pesar de que en la práctica o para la comprobación de la presente invención se pueden emplear métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Por otra parte, los materiales, métodos y ejemplos se ofrecen únicamente a título ilustrativo y no pretenden establecer limitaciones.

En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se recogen en las ilustraciones adjuntas y en la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto en las ilustraciones y la descripción detallada, así como en las reivindicaciones.

DESCRIPCIÓN DE LAS ILUSTRACIONES

La Figura 1 es una muestra esquemática de la preparación inicial para la descelularización de un corazón. La aorta, la arteria pulmonar y la vena cava superior están canuladas (A, B, C, respectivamente) y la vena cava inferior, la arteria braquiocefálica, la arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda están unidas. Las flechas indican la dirección de la perfusión en anterógrado y retrógrado.

La Figura 2 es un esquema de una realización de un aparato de descelularización / recelularización.

Los símbolos de referencia parecidos en las diversas ilustraciones indican elementos parecidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En general, los órganos sólidos tienen tres componentes principales: la matriz extracelular (ECM) , las células que la integran y un lecho vascular. La descelularización de un órgano sólido aquí descrita elimina la mayoría o la totalidad de los componentes celulares, al tiempo que preserva sustancialmente la matriz extracelular (ECM) y el lecho vascular. Entonces se puede emplear un órgano sólido descelularizado como soporte para la recelularización. Los mamíferos de los que se pueden obtener órganos sólidos incluyen, a título meramente enunciativo, roedores, cerdos, conejos, vacuno, ovejas, perros y humanos. Los órganos y tejidos utilizados en los métodos aquí descritos pueden ser cadavéricos.

Los órganos sólidos a los que se hace referencia en el presente incluyen, a título meramente enunciativo, el corazón, el hígado, los pulmones, los músculos esqueléticos, el cerebro, el páncreas, el bazo, los riñones, el útero y la vejiga. Un órgano sólido utilizado en el presente se refiere a un órgano que tiene un sistema de vasculatura "sustancialmente cerrado". Un sistema de vasculatura "sustancialmente cerrado" con respecto a un órgano quiere decir que, tras la perfusión con un líquido, la mayoría del líquido está contenido en el órgano sólido y no se sale del mismo, dando por supuesto que los principales vasos están canulados, ligados o limitados de otro modo. A pesar de contar con un sistema de vasculatura "sustancialmente cerrado", muchos de los órganos sólidos anteriormente mencionados tienen vasos de "entrada" y "salida" definidos, que son útiles para introducir y mover... [Seguir leyendo]

1. Un método ex vivo de descelularización de un órgano de mamífero o un tejido vascularizado de mamífero, que comprende:

proporcionar un órgano de mamífero que posee una matriz extracelular y un lecho vascular sustancialmente 5 cerrado y células integradas en la matriz extracelular, o proporcionar un tejido vascularizado de mamífero que tiene una matriz extracelular y un árbol vascular y células integradas en la matriz extracelular;

canular dicho órgano o tejido en uno o más vasos y/o conductos, produciendo así un órgano o tejido canulado; y perfundir la vasculatura de dicho órgano o tejido vascularizado canulado con un primer medio de disrupción 10 celular, a través de dichas una o más canulaciones.

2. El método de la reivindicación 1, en donde esencialmente la totalidad del lecho vascular es contactado con el primer medio de disrupción celular.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho órgano de mamífero es un corazón, un riñón, un hígado,

un bazo, un páncreas, vejiga, músculo esquelético, intestino delgado, intestino grueso, estómago, hueso, cerebro 15 o un pulmón.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicha perfusión es muldireccional desde cada vaso y/o conducto canulado, particularmente comprende adicionalmente perfundir dicho órgano canulado con un segundo medio de disrupción celular, a través de dicha una o más canulaciones, particularmente en donde dicho segundo medio de disrupción celular comprende DNasa.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha perfusión se prolonga aproximadamente entre 2 y 12 horas por gramo de tejido del órgano.

6. Un órgano de mamífero descelularizado o tejido de mamífero vascularizado, que comprende una matriz extracelular descelularizada de dicho órgano o tejido, en donde dicha matriz extracelular comprende una superficie exterior y en donde dicha matriz extracelular, incluyendo el lecho o árbol vascular, conserva sustancialmente la morfología de dicha matriz extracelular previa a la descelularización, y en donde dicha superficie exterior se mantiene sustancialmente intacta, en donde dicho órgano o tejido se puede obtener por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y donde el órgano es un bazo; un páncreas; un pulmón; un riñón porcino, bovino, de oveja, canino o humano; o un hígado porcino, bovino, de oveja, canino o humano.

7. El tejido descelularizado de la reivindicación 6, en donde dicho tejido es cadavérico o en donde dicho tejido es médula espinal, tráquea o una articulación o una porción de ellos.

8. Una porción de un órgano de mamífero descelularizado, que comprende:

una matriz extracelular descelularizada de dicha porción, en donde dicha matriz extracelular comprende una superficie exterior y en donde dicha matriz extracelular, incluyendo el árbol vascular, conserva sustancialmente la morfología de dicha matriz extracelular antes de la descelularización, en donde dicha superficie exterior está sustancialmente intacta y en donde dicha porción se puede obtener por el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

9. Un método ex vivo para producir un órgano o una porción vascularizada de un órgano o tejido, que comprende:

proporcionar una perfusión de un órgano de mamífero descelularizado, una perfusión de una porción 40 vascularizada descelularizada de un órgano de mamífero o una perfusión de un tejido de mamífero vascularizado descelularizado de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8; y a) contactar dicho órgano, porción o tejido descelularizado con una población de células regenerativas en condiciones en las que dichas células regenerativas se injerten, multipliquen y/o diferencien dentro de dicho órgano, porción o tejido descelularizado, en donde las células son células embriónicas de origen no humano; o 45 b) contactar dicho órgano o tejido descelularizado con uno o más compuestos para favorecer o estimular las células durante el proceso de recelularización.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dichas células regenerativas son inyectadas o perfundidas en dicho órgano o tejido descelularizado.

11. El método de la reivindicación 9a) , en donde dicho órgano descelularizado es un corazón, un riñón, un hígado, un

bazo, un páncreas, una vejiga, músculo esquelético, intestino delgado, intestino grueso, estómago, hueso, 5 cerebro o un pulmón.

12. El método de la reivindicación 9, en donde el número de dichas células regenerativas unidas a dicho órgano o tejido descelularizado es aproximadamente de entre 1000 células/mg de tejido y 10 000 000 de células/mg de tejido.

13. El método de la reivindicación 9, en donde dichas células regenerativas son células pluripotentes o son células

madre embriónicas distintas de células embriónicas humanas o un subconjunto de ellas, células de cordón umbilical o un subconjunto de ellas, células de médula espinal o un subconjunto de ellas, células de sangre periférica o un subconjunto de ellas, células progenitoras o células madre derivadas de un adulto o un subconjunto de ellas, células progenitoras o células madre obtenidas de tejido o un subconjunto de ellas, células madre mesenquimales (MSC, por sus siglas en inglés) o un subconjunto de ellas, células progenitoras o células madre obtenidas de músculo esquelético o un subconjunto de ellas, células progenitoras de adulto multipotentes (MAPC, por sus siglas en inglés) o un subconjunto de ellas, células madre cardiacas (CSC, por sus siglas en inglés) o un subconjunto de ellas, células madre multipotentes obtenidas de un corazón adulto o un subconjunto de ellas, fibroblastos cardiacos, células endoteliales de microvasculatura cardiaca o células endoteliales aórticas.

14. El método de la reivindicación 9, en donde dichas células regenerativas son alogénicas o xenogénicas de dicho órgano descelularizado; o en donde dichas células regenerativas son alogénicas o xenogénicas de dicha matriz extracelular, o en donde el órgano o tejido está expuesto a una presión o carga mecánica.

15. El método de la reivindicación 9b) , en donde dicho compuesto es un factor de crecimiento o en donde dicho compuesto es un factor que modifica la cascada de coagulación, o en donde dicho compuesto es un agente modulador de la respuesta inmune.