MÉTODO PARA LA PREDICCIÓN DEL RIESGO DE DESARROLLAR LA ENFERMEDAD DE DEGENERACIÓN MACULAR ASOCIADA A LA EDAD EN LA POBLACIÓN ESPAÑOLA.

Método para predecir el riesgo de desarrollar la enfermedad de degeneración macular asociada a la edad en población caucásica española que se caracteriza porque se utilizan para el cálculo marcadores genéticos prevalentes en población afectada por dicha enfermedad en relación a población sana.

MÉTODO PARA LA PREDICCIÓN DEL RIESGO DE DESARROLLAR LA ENFERMEDAD DE DEGENERACIÓN MACULAR ASOCIADA A LA EDAD EN LA POBLACIÓN ESPAÑOLA

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuentra dentro de los sectores sanitario, biotecnológico, bioquímico, y químico-farmacéutico. El objeto de la invención es un método de predicción del riesgo de desarrollar la enfermedad de degeneración macular asociada a la edad en la población caucásica española, basado en el uso marcadores genéticos. Podrá ser aplicado en investigaciones básicas o aplicadas en biología molecular, bioquímica, biotecnología, genética o en la práctica clínica para diversos fines.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La degeneración macular asociada a la edad (en lo sucesivo DMAE) es la causa más común de deficiencia visual en la población de edad avanzada, es una de las enfermedades graves que afectan a casi el 10% de los caucásicos mayores de 75 años.

En población española, el 4, 2 % de las personas mayores de 60 años padece DMAE

al menos en un ojo. En el año 2005, 311.000 españoles, mayores de 55 años, padecían DMAE. Debido al progresivo envejecimiento de la población se estima que en el año 2025

este número se elevará a 565.000 personas (Damián et al. (2006) Aten. Prim. 38:51-57) .

El notable progreso que se está haciendo en la búsqueda de tratamientos para la DMAE ha puesto de manifiesto la necesidad de mejorar los métodos para identificar

individuos en riesgo de desarrollar esta enfermedad en estados presintomáticos o muy

tempranos de la enfermedad, para que estas personas puedan ser controladas a fin de retrasar, detener o revertir la aparición de la enfermedad.

La DMAE es una enfermedad compleja en la que factores genéticos y ambientales contribuyen a su desarrollo. Se han realizado muchos esfuerzos para identificar los marcadores genéticos que pudieran ser utilizados para predecir el riesgo de aparición de DMAE y medir su progresión (Klein et al. (2005) Science 308: 385-389; Hainese et al.

(2005) Science 308:419-421; Edwards et al. (2005) Science 308:421-424; Hughes et al.

(2006) Nat. Genet. 38:1173-1177 (2006) ; Jakobsdottir et al. (2005) Am. J. Hum. Genet.

77:389-407; Gold et al. (2006) Nat. Genet. 38:458-462; Yates et al. (2007) N. Engl. J.

Med. 357:553-556; Ross et al. (2007) Expert. Rev. Ophthalmol. 2:443–457) . Entre los marcadores genéticos mejor conocidos por su contribución al desarrollo de la enfermedad

están:

-El gen CFH (cromosoma 1q32, Gen ID 3075)

-El factor B del complemento (cromosoma 6p21.3, Gen ID 629)

-El componente 2 (C2) del complemento (cromosoma 6p21.3, Gen ID 717)

-El gen PLEKHA1/ARMS2/HtrA1/LOC387715 (cromosoma 10q26, Gen ID

387715/5654/59338)

Aunque se han encontrado asociaciones de DMAE con otros marcadores genéticos adicionales, incluyendo por ejemplo APOE, ELOVL4, TLR4 y otros (Schultz et al. (2003) Arch Ophthalmol 121:679–683; Ayyagari et al. (2001) Ophthalmic Genet. 22:233-239; Cho et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50:5614–5618) , no se han contrastado consistentemente en otros trabajos, y por lo tanto, se necesitan más estudios antes de que estos marcadores puedan ser usados para predecir riesgo de desarrollar DMAE.

Basándose en el conocimiento previo sobre los marcadores genéticos descritos en algunas de las publicaciones anteriormente señaladas, se han desarrollado sistemas de predicción de riesgo de padecer DMAE que analizan de forma individualizada o en combinación distintos polimorfismos. Entre estos sistemas de predicción se pueden destacar los descritos en los documentos: WO/2005/083126, WO/2006/088950, WO/2006/096737, WO/2006/133295, WO/2007/044897, WO/2007/095185, WO/2007/120975, US/2008/025500 WO/2008/008986, WO/2008/013893, WO/2008/110824, WO/2009/105757, WO/2010/075519, WO/2011/039650.

Además de los polimorfismos de nucleótido único (también referido en la presente memoria como polimorfismos de nucleótido simple o por su acrónimo inglés SNP –Single-Nucleotide Polymorphism–) , se han descrito regiones cuya deleción afecta al riesgo de padecer DMAE. En este sentido, se ha descrito que la deleción de la región de los genes CFHR1-CFHR3 (delCFHR3-CFHR1) es un factor de protección de la enfermedad (Hughes et al. (2006) Nat. Genet. 38:1173-1177) . En relación a dicha deleción, se ha descrito que está en desequilibrio de ligamiento con un polimorfismo del intrón 12 del gen CFH, rs 6677604, (Gharavi et al. (2011) Nat Genet. 43:321-327) .

En relación a los métodos de predicción conocidos en el estado de la técnica, es importante señalar que el éxito del análisis de riesgo basado en marcadores genéticos está estrechamente relacionado con poblaciones concretas. Por consiguiente, para predecir con precisión el riesgo en un individuo es necesario establecer los marcadores adecuados y su implicación en la determinación del riesgo asociado a su presencia o ausencia para la población a la que pertenezca el individuo (Friedman et al. (2004) Arch. Ophthalmol. 122:564-572) . En concreto, ninguno de los métodos conocidos puede predecir con precisión el riesgo de padecer DMAE en población caucásica española puesto que ninguno de ellos se ha validado sobre esta población.

En este mismo sentido, no todos los marcadores genéticos proporcionan la misma precisión en la predicción del riesgo de padecer una enfermedad en cada población y por lo tanto es importante elegir una adecuada combinación de marcadores para cada población a la hora de establecer el algoritmo predictivo (Seldin et al. (2006) PlosGenetics 2:e143) . Ninguno de estos métodos de predicción de riesgo de desarrollar DMAE descritos hasta la fecha combina las mutaciones puntuales con las mutaciones de deleción y, por lo tanto, tienen una capacidad de predicción de riesgo más limitada.

La mayoría de los métodos de predicción de riesgo de DMAE descritos hasta la fecha se basan en procedimientos experimentales que detectan las variantes de forma individualizada y por consiguiente, son muy laboriosos y costosos. Solo algunos de los sistemas descritos permiten la detección múltiple de mutaciones puntuales mediante la hibridación de cebadores específicos en sistemas de micromatrices, pero que tienen el inconveniente de ser algo menos precisos.

Por consiguiente, la invención que se desvela en este documento pretende solventar aquellas desventajas que presentan todos los métodos de predicción del riesgo de desarrollar DMAE conocidos hasta el momento, como son: (a) el hecho de no ser completamente fiables en población caucásica española para la cual no han sido contrastados específicamente, y (b) el hecho de ser bastante tediosos, costosos y no siempre suficientemente precisos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se demuestra la eficacia predictiva de un nuevo método basado en marcadores genéticos de DMAE específicamente contrastados en población caucásica española.

Por un lado, se basa en que por primera vez se demuestra que el desequilibrio de ligamiento entre rs6677604 y delCFHR3-CFHR1 en población caucásica española es completo, como pone de manifiesto un análisis de estos dos polimorfismos en 166 muestras de individuos de dicha población, lo que permite utilizar el polimorfismo rs6677604 para la predicción del riesgo de desarrollar DMAE en sustitución de la deleción delCFHR3-CFHR1.

Por otro lado, se basa en los resultados de otros estudios que se describen en la presente memoria, que han permitido demostrar por primera vez que la variante CFHR1*A de la proteína CFHR1 está fuertemente asociada con el desarrollo DMAE. Hay que señalar que, recientemente, se ha descrito la existencia de varios polimorfismos en el gen CFHR1 que se combinan en dos grupos para definir dos variantes de la proteína CFHR1 denominadas CFHR1*A y CFHR1*B. En particular, la variante CFHR1*B se ha relacionado con predisposición al síndrome hemolítico urémico (Abarrategui-Garrido et al. Blood (2009) 114:4261-4271) . Sin embargo, no se ha descrito previamente la implicación de aquellos polimorfismos que definen las variantes CFHR1*A y CFHR1*B con DMAE y, por lo tanto, estos polimorfismos no se han utilizado hasta la fecha para predecir el riesgo de desarrollar DMAE. En consecuencia, la variante CFHR1*A puede ser utilizada como un nuevo marcador de riesgo de esta enfermedad, sustituyendo a otros previamente utilizados y simplificando el método predictivo.

Asimismo, la presente invención presenta como novedad la utilización de un procedimiento de detección múltiple de polimorfismo mucho más seguro y menos laborioso que... [Seguir leyendo]

1. Un método de predicción de riesgo de padecer degeneración macular asociada a la edad en población caucásica española que comprende los siguientes pasos:

a. determinar en una muestra de DNA un genotipo que comprende un conjunto de polimorfismos de nucleótido simple (SNP) marcadores de dicha degeneración macular,

b. calcular un valor de probabilidad de padecer degeneración macular asociada a la edad mediante un algoritmo que comprende escoger al menos un parámetro dependiente de dicho genotipo previamente determinado.

2. Un método según la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra de DNA se obtiene por extracción de DNA de una muestra biológica previamente obtenida.

3. Un método según la reivindicación 2, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo compuesto por: una muestra de sangre, una muestra de saliva y una muestra de mucosa bucal.

4. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho conjunto de polimorfismos comprende el polimorfismo (SNP) rs388862.

5. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho conjunto de polimorfismos comprende polimorfismos (SNP) rs6677604 y rs388862.

6. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho conjunto de polimorfismos comprende polimorfismos (SNP) rs800292, rs6677604, rs4151667, rs12614, rs641153, rs10490924, y rs388862.

7. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la determinación del genotipo comprende las siguientes etapas:

c. una amplificación de la muestra de DNA con una primera combinación de cebadores mediante una técnica de PCR múltiple,

d. una determinación de SNPs de dicha muestra de DNA amplificada con una segunda combinación de cebadores específicos mediante una técnica de minisecuenciación.

8. Un método según la reivindicación 7, caracterizado porque previamente a la etapa d, dicha muestra de DNA amplificada se trata con fosfatasa alcalina y exonucleasa I.

9. Un método según una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque dicha minisecuenciación comprende:

e. una reacción de extensión de la segunda combinación de cebadores específicos con al menos un dideoxinucleótido marcado, mediante tratamiento de dicha muestra de DNA amplificado con una mezcla de dicha segunda combinación de cebadores y una mezcla de dideoxinucleótidos de adenina, citosina, guanina y timina marcados fluorescentemente de manera selectiva,

f. añadir fosfatasa alcalina una vez finalizada la reacción de extensión,

g. registrar un electroforegrama mediante electroforesis capilar.

10. Un método según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque en la etapa de amplificación dicha primera combinación de cebadores comprende los cebadores de secuencias SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 ySEQ ID No: 10.

11. Un método según una de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque en la etapa de minisecuenciación dicha segunda combinación de cebadores específicos comprende los cebadores de secuencias SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16 y SEQ ID No: 17.

12. Un método según una de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque la determinación del genotipo comprende las siguientes etapas:

e. una amplificación de la muestra de DNA mediante una técnica de PCR múltiple con una combinación de cebadores que comprende al menos los cebadores de secuencia SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9 ySEQ ID No: 10;

f. una determinación de SNPs de dicha muestra de DNA amplificada mediante una técnica de minisecuenciación con una segunda combinación de cebadores específicos que comprende al menos los cebadores de secuencias SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16 y SEQ ID No: 17.

13. Un método según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque dicho algoritmo se define por la siguiente ecuación:

Probabilidad = ez/ (1+ez) ,

donde z es un valor que resulta de sumar un conjunto de parámetros que consiste en: a, b1, b2, b3, b4 y b5, donde I. a es un parámetro igual a un valor -0, 065,

II. b1 es un parámetro dependiente del genotipo previamente determinado cuyo valor se selecciona independientemente según la siguiente relación: -b1 es igual a 0 si dicho genotipo comprende SNP rs388862 C/C y SNP rs6677604 G/G; -b1 es igual a 0, 608 si dicho genotipo comprende SNP rs388862 G/G y SNP rs6677604 G/G -b1 es igual a -1, 466 si dicho genotipo comprende SNP rs388862 -/-y SNP rs6677604 A/A -b1 es igual a 0, 343 si dicho genotipo comprende SNP rs388862 G/C y SNP rs6677604 G/G -b1 es igual a -0, 939 si dicho genotipo comprende SNP rs388862 G/-y SNP rs6677604 G/A

-b1 es igual a -1, 082 si dicho genotipo comprende SNP rs388862 C/-y SNP rs6677604 G/A

III. b2 es un parámetro dependiente del genotipo previamente determinado cuyo valor

se selecciona independientemente según la siguiente relación: -b2 es igual a 0 si dicho genotipo comprende SNP rs800292 G/G -b2 es igual a -0, 742 si dicho genotipo comprende SNP rs800292 G/A -b2 es igual a -0, 782 si dicho genotipo comprende SNP rs800292 A/A

IV. b3 es un parámetro dependiente del genotipo previamente determinado cuyo valor

se selecciona independientemente según la siguiente relación: -b3 es igual a 0 si dicho genotipo comprende SNP rs10490924 G/G -b3 es igual a 0, 911 si dicho genotipo comprende SNP rs10490924 G/T -b3 es igual a 2, 14 si dicho genotipo comprende SNP rs10490924 T/T

V. b4 es un parámetro dependiente del genotipo previamente determinado cuyo valor

se selecciona independientemente según la siguiente relación: -b4 es igual a -1, 186 si dicho genotipo comprende SNP rs4151667 T/A

VI. b5 es un parámetro dependiente del genotipo previamente determinado cuyo valor se selecciona independientemente según la siguiente relación: -b5 es igual a 0 si dicho genotipo comprende un genotipo seleccionado entre uno del grupo compuesto por: 5 i. una combinación de SNP rs12614 C/C y SNP rs641153 A/A,

ii. una combinación de SNP rs12614 T/T y SNP rs641153 G/G,

iii. una combinación de SNP rs12614 C/T y SNP rs641153 G/A; -b5 es igual a 0, 471 si dicho genotipo comprende:

iv. una combinación de SNP rs12614 C/C y SNP rs641153 G/G;

-b5 es igual a -0, 382 si dicho genotipo comprende un genotipo seleccionado entre uno del grupo compuesto por:

v. una combinación de SNP rs12614 C/C y SNP rs641153 G/A,

vi. una combinación de SNP rs12614 C/T y SNP rs641153 G/G.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3