Método para impedir la fusión virus:célula inhibiendo la función de la región de inicio de fusión en virus de ARN que tienen proteínas de envoltura fusogénicas de membrana de clase I.

Un péptido inhibidor de fusión vírica aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEC ID N.º: 5,

(b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en 8 o más residuos aminoacídicos de SEC IDN.º: 5, y

(c) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEC ID N.º: 5 que incluye una omás sustituciones aminoacídicas conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a lasecuencia de SEC ID N.º: 5;

para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus.

Método para impedir la fusión virus:célula inhibiendo la función de la región de inicio de fusión en virus de ARN que tienen proteínas de envoltura fusogénicas de membrana de clase I

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. de número de serie 60/517181 presentada el 4 de noviembre de 2003.

Campo de la invención La presente invención se refiere a péptidos para su uso en la prevención o inhibición de infección vírica por un paramixovirus de una célula (evitando por lo tanto la entrada del genoma vírico dentro del citoplasma celular, una etapa requerida para infección vírica) . La presente invención proporciona composiciones y usos de las mismas en la prevención de infección por un paramixovirus interfiriendo con su región de inicio de fusión (FIR) .

Introducción Todos los virus deben unirse a, e invadir, sus células objetivo para multiplicarse. Para virus animales provistos de envoltura, incluyendo virus de ARN que tienen proteínas de membrana de clase I (virus de tipo I) , el proceso implica (a) unión del virión a la célula objetivo, (b) fusión de la membrana del virus con la membrana plasmática o con una membrana celular interna, (c) desestabilización de la envoltura vírica y de la membrana celular en la zona fusionada para crear un poro de fusión, (d) transferencia del ARN vírico a través del poro y (e) modificación de la función celular por el ARN vírico.

La fusión de la membrana vírica y la envoltura celular, etapas (b) y (c) anteriores, está mediada por la interacción de una glucoproteína transmembrana vírica (proteína de fusión) con proteínas de superficie y membranas de la célula objetivo. Estas interacciones causan cambios conformacionales en la proteína de fusión que dan como resultado la inserción de un péptido de fusión vírico dentro de la membrana de la célula objetivo. Esta inserción está seguida por cambios conformacionales adicionales en la proteína de fusión que llevan a proximidad cercana a la envoltura celular y a las membranas celulares y que dan como resultado la fusión de las dos bicapas membranosas.

Un virus es incapaz de dispersarse y propagarse dentro de su hospedador si este proceso de fusión está alterado. La alteración intencionada de este proceso de fusión se puede lograr dirigiendo péptidos y peptidomiméticos homólogos a secuencias de proteínas de fusión, anticuerpos que reconocen la proteína de fusión y otros factores que actúan contra la proteína de fusión.

Antecedentes de la invención Similitudes estructurales entre proteínas de fusión de clase I de virus de ARN

La hemaglutinina 2 (HA2) del virus influenza, un ortomixovirus, es la proteína de fusión de virus de ARN de clase I prototípica y contiene un dominio hidrófobo aminoterminal, referido como el péptido de fusión, que se expone durante la escisión de la proteína precursora de hemaglutinina. Las proteínas de fusión de membrana de virus de ARN de varias diversas familias incluyendo arenavirus, coronavirus, filovirus, ortomixovirus, paramixovirus y retrovirus,

comparten varias características estructurales comunes con HA2 y se han referido como proteínas de fusión vírica de clase I. Se ha observado que la proteína de fusión del VIH-1, la glucoproteína transmembrana y otras proteínas transmembrana retrovíricas, como aquellas de los ortomixovirus y paramixovirus, poseen un dominio peptídico de fusión hidrófoba expuesto durante la escisión de un precursor (gp160) (Gallaher, 1987; Gonzalez-Scarano y cols., 1987) . En base a estas similitudes y a algoritmos de ordenador que predicen configuraciones de proteínas, se ha sugerido (Gallaher y cols., 1989) que la parte externa (ectodominio, extremo amino) de la proteína transmembrana de VIH-1 y las proteínas transmembrana de otros retrovirus, podrían ajustarse todas al armazón de estructura de HA2 según se determina por cristalografía de rayos X (Wilson, Skehel y Wiley, 1981) .

En base a estas observaciones, se predijo que las proteínas retrovíricas transmembrana contengan varias 55 características estructurales además del péptido de fusión en común con la estructura conocida de HA2, incluyendo una hélice aminoterminal expandida (hélice N, normalmente una "héptada repetitiva" o "cremallera de leucina") , una hélice carboxiloterminal (hélice C) y un resto aromático proximal al dominio transmembrana. La presencia de al menos cuatro de estos cinco dominios define a una proteína de envoltura vírica como una proteína de fusión de clase I. Este modelo de proteínas transmembrana retrovíricas se confirmó subsiguientemente por determinaciones estructurales y análisis mutacionales (Chan y cols., 1997; Kowalski y cols., 1991; Weissenhorn y cols., 1997) . Están presentes restos estructurales comunes no solo en proteínas de fusión de ortomixovirus y retrovirus, sino también en aquellas deparamixovirus, filovirus (tales como virus Ébola, EboV) (Gallaher, 1996) y arenavirus (Gallaher, DiSimone y Buchmeier, 2001) . El modelo estructural de Gallaher de la proteína de fusión EboV (GP2) se ha confirmado también por métodos cristalográficos de rayos x (Malashkevich y cols., 1999; Weissenhom y cols., 1998) .

La figura 1 muestra los cinco dominios, previamente descritos, de las proteínas de fusión de las seis familias de los virus de tipo I. Las proteínas de fusión se originan en un péptido de fusión hidrófoba, terminan en un péptido ancla e incorporan una hélice alfa aminoterminal expandida (hélice N, usualmente una "héptada repetitiva" o una "cremallera de leucina") una hélice alfa carboxiterminal (hélice C) (Carr y Kim, 1993; Suárez y cols., 2000; Wilson, Skehel y Wiley, 1981) y algunas veces un resto aromático proximal a la envoltura del virión. También se muestra el sexto dominio, la región de inicio de la fusión (FIR) , descubierta por los autores de la presente invención.

Inhibición de la fusión en los virus de tipo I

Los intentos anteriores por los autores de la presente invención (Garr y ) y otros para diseñar péptidos y peptidomiméticos, anticuerpos y otros factores que inhiban la fusión en virus tipo I se han centrado en el péptido de fusión, la hélice N y la hélice C de las proteínas de fusión. En el caso de los péptidos de fusión, se ha encontrado que análogos de los ortomixovirus y paramixovirus (Richardson, Scheid y Choppin, 1980) y dominios de péptidos de fusión (Gallaher y cols., 1992; Owens y cols., 1990; Silburn y cols. 1998) , bloquean la infección vírica, presumiblemente formando heteroagregados inactivos. Se ha encontrado que los péptidos correspondientes a partes de la hélice N y la 15 hélice C son efectivos en inhibir infección vírica tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, un péptido de 17 aminoacídicos correspondiente a la parte carboxiterminal de la hélice N de la proteína de fusión del VIH-1, definida como la región CS3, bloqueó la infección con VIH (Qureshi y cols., 1990) . Además, otros péptidos inhibidores de hélice N y hélice C se desarrollaron en base al modelo estructural de proteína de fusión (Wild, Greenwell y Matthews, 1993; Wild y cols., 1992) , incluyendo el fármaco peptídico anti-VIH-1 de hélice C DP 178 (T-20 o FUZEON®) . DP 178 se solapa con la hélice C y el dominio proximal de anclaje aromático e inhibe la fusión del virión de VIH-1:célula a concentraciones muy bajas (inhibición del 50% a 1, 7 nM) alcanzables in vivo tras la inyección. En un ensayo clínico, 100 mg/día de DP178 causaron una reducción de aproximadamente 100 veces en la carga de VIH-1 en plasma de individuos infectados (Kilby y cols., 1998) . Este resultado ha motivado ampliamente la búsqueda de otros péptidos inhibidores de VIH-1 en base a la estructura de proteínas transmembrana (Pozniak, 2001; Sodroski, 1999) . Los inhibidores peptídicos de paramixovirus han mostrado también inhibir la replicación vírica (Lambert y cols., 1996; Young y cols., 1999) . Los estudios por Watanabe y colaboradores sugieren que un enfoque similar de marcar como objetivo la hélice N y la hélice C de EboV GP2 puede conducir también a inhibidores útiles (Watanabe y cols., 2000) . Anticuerpos neutralizantes dirigidos contra partes de los dominios de la proteína de fusión han mostrado también inhibición de la fusión virión:célula.

Observaciones en VIH-1

Se ha dedicado un gran acuerdo de estudio a la inhibición de la fusión del virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1, uno de los virus de ARN de tipo I. Bolognesi y cols. (documento 5.464.933) y los autores de la presente invención 35 (Garr y , documento USPN 5.567.805) enseñan que la matanza de células mediada por VIH se puede inhibir introduciendo péptidos que se unan a partes de... [Seguir leyendo]

1. Un péptido inhibidor de fusión vírica aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEC ID N.º: 5,

(b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en 8 o más residuos aminoacídicos de SEC ID N.º: 5, y

(c) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEC ID N.º: 5 que incluye una o más sustituciones aminoacídicas conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a la secuencia de SEC ID N.º: 5;

para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus. 15

2. Un péptido según se define en la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo macromolecular en el extremo aminoterminal del péptido.

3. Un péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo, o un grupo macromolecular en el extremo carboxiterminal del péptido.

4. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una infección por 25 paramixovirus, en el que la infección por paramixovirus es una infección por virus del sarampión.

5. El péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus, en el que la infección por paramixovirus se selecciona del grupo que consiste en paperas, moquillo y enfermedad de Newcastle.

6. Uso de un péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección por paramixovirus en un paciente.

7. El uso de la reivindicación 6 en el que la infección por paramixovirus es una infección por virus del sarampión. 35

8. Una molécula de ADN recombinante que permite a un paciente producir o estimula a un paciente a producir el péptido según se define en la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus en un paciente.

9. Uso de una molécula de ADN recombinante que permite a un paciente producir o estimula a un paciente a producir el péptido según se define en la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por paramixovirus en un paciente.

10. El uso de la reivindicación 9 en el que la infección por paramixovirus es una infección por virus del sarampión. 45

11. Un agente inhibidor de la fusión vírica que comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en 8 a 50 residuos de aminoácidos para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de un péptido de la reivindicación 1.

12. El agente inhibidor de la fusión vírica según define la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de una infección por paramixovirus que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenciloxi, un grupo dansilo, un grupo t-butoxicarbonilo, un grupo hidrófobo, o un grupo macromolecular en el extremo aminoterminal del mismo.

13. El agente inhibidor de la fusión vírica según define la reivindicación 11 para su uso en el tratamiento de una 55 infección por paramixovirus que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo, o un grupo macromolecular en el extremo carboxiterminal del mismo.

14. Uso de un agente inhibidor de la fusión vírica de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por paramixovirus en un paciente.