Un péptido inhibidor de la fusión vírica aislado seleccionado entre el grupo compuesto por:

a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1,

b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,

c) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1 que incluye una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de SEC ID n.º 1, y

d) un péptido análogo que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1 que incluye una u más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de los 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,

para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus.

Procedimiento de prevención de la fusión virus célula inhibiendo la función de la región de iniciación de fusión en virus de ARN que tienen proteínas de envoltura fusogénicas de membrana de clase I

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos número 60/517181 presentada el 4 de noviembre de 2003.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos para su uso en la prevención o inhibición de la infección vírica por un arenavirus de una célula (previniendo de este modo la liberación del genoma vírico dentro del citoplasma celular, etapa requerida para la infección vírica) . La presente invención proporciona composiciones y usos de las mismas para prevenir la infección por un arenavirus interfiriendo con su región de iniciación de fusión (FIR, por sus siglas en inglés) .

Introducción

Todos los virus deben unirse a sus células diana e invadirlas para replicarse. Para los virus animales con envoltura, incluyendo virus de ARN que tienen proteínas de fusión de membrana de clase I (virus de tipo I) , el proceso implica: a) unión del virión a la célula diana, b) fusión de la envoltura del virus con la membrana plasmática o con una membrana celular interna, c) desestabilización de la envoltura vírica y de la membrana celular en el área de fusión para crear un poro de fusión, d) transferencia del ARN vírico a través del poro y e) modificación de la función celular por el ARN vírico.

La fusión de la membrana vírica y de la envuelta celular, etapas b) y c) anteriores, está mediada por la interacción de una glucoproteína transmembrana vírica (proteína de fusión) con las proteínas de superficie y las membranas de la célula diana. Estas interacciones causan cambios conformacionales en la proteína de fusión que dan lugar a la inserción de un péptido de fusión vírico en la membrana de la célula diana. Esta inserción va seguida de cambios conformacionales adicionales dentro de la proteína de fusión que acercan la envoltura vírica y las membranas celulares y dan lugar a la fusión de las dos bicapas de la membrana.

Un virus es incapaz de extenderse y propagarse dentro de su huésped si se interrumpe este proceso de fusión. Puede lograrse la interrupción intencionada de este proceso de fusión dirigiendo péptidos y homólogos que mimetizan a péptidos hacia secuencias de la proteína de fusión, anticuerpos que reconocen la proteína de fusión y otros factores que actúan frente a la proteína de fusión.

Antecedentes de la invención

Similitudes estructurales entre las proteínas de fusión de los virus de ARN de clase I.

La hemaglutinina 2 (HA2) del virus de la gripe, un ortomixovirus, es el prototipo de proteína de fusión de los virus de ARN de clase I y contiene un dominio hidrófobo amino terminal denominado como péptido de fusión, que se expone durante la escisión de la proteína precursora de la hemaglutinina. Las proteínas de fusión de membrana de los virus de ARN de diversas familias, como arenavirus, coronavirus, filovirus, ortomixovirus, paramixovirus y retrovirus, comparten algunas características estructurales comunes con HA2 y se ha denominado proteínas de fusión vírica de clase I. Se ha observado que la proteína de fusión del VIH-1, la glucoproteína de transmembrana y otras proteínas de transmembrana retrovíricas, como las de ortomixovirus y paramixovirus, poseen un dominio de péptido de fusión hidrófobo expuesto durante la escisión de un precursor (gp160) (Gallaher, 1987; Gonzalez-Scarano y col., 1987) . En base a estas similitudes y a algoritmos informáticos que predicen la configuración de las proteínas, se ha sugerido (Gallaher y col., 1989) que la porción externa (ectodominio, extremo amino terminal) de la proteína de transmembrana del VIH-1 y las proteínas de transmembrana de otros retrovirus, pueden coincidir todas ellas con el esqueleto de la estructura de HA2 como se determina mediante cristalografía de rayos X (Wilson, Skehal y Wiley, 1981) .

En base a estas observaciones, se ha previsto que las proteínas de transmembrana retrovíricas contienen varías características estructurales además del péptido de fusión en común con la estructura conocida de HA2, que incluyen una hélice en el extremo amino terminal extendida (hélice N normalmente una "héptada repetida" o "cremallera de leucina") , una hélice en el extremo carboxilo terminal (hélice C) y un motivo aromático próximo al dominio de transmembrana. La presencia de al menos cuatro de estos cinco dominios define a una proteína de la envoltura vírica como una proteína de fusión de clase I. Este modelo de proteína de transmembrana retrovírica se confirmó mediante determinaciones estructurales y análisis mutacional posteriores (Chan y col., 1997; Kowalski y col., 1991; Weissenhorn y col., 1997) . Los motivos estructurales comunes están presentes no solo en las proteínasde fusión de ortomixovirus y retrovirus sino también en las de paramixovirus, filovirus (como el virus del Ébola, EboV) (Gallaher, 1996) y arenavirus (Gallaher, DiSimone y Buchmeier, 2001) . El modelo estructural de Gallaher de la proteína de fusión de EboV (GP2) también se ha confirmado mediante procedimientos de cristalografía de rayos X (Malashkevich y col., 1999; Weissenhorn y col., 1998) .

En la figura 1 se muestran los cinco dominios descritos previamente de las proteínas de fusión de las seis familias de virus de tipo 1. Las proteínas de fusión se originan en un péptido de fusión hidrófobo, terminan en un péptido de anclaje e incorporan una hélice alfa en el extremo aminoterminal extendida (hélice N, normalmente una “héptada repetida" o una “cremallera de leucina”) , una hélice alfa en el extremo carboxilo terminal (hélice C) (Carr y Kim, 1993; Suarez y col., 2000; Wilson, Skehel y Wiley, 1981) y algunas veces un motivo aromático próximo a la envoltura del virión. También se muestra el sexto dominio, la región de iniciación de fusión (FIR) , descrita por los presentes inventores.

Inhibición de la fusión en virus de tipo I

Los intentos previos de los presentes inventores (Garr y ) y otros laboratorios para diseñar péptidos y miméticos de péptido, anticuerpos y otros factores que inhiban la fusión en los virus de tipo I se han centrado en el péptido de fusión, la hélice N y la hélice C de las proteínas de fusión. En el caso de los péptidos de fusión, se ha encontrado que análogos de los dominios de péptidos de fusión de ortomixovirus y paramixovirus (Richardson, Scheid y Choppin, 1980) y VIH-1 (Gallaher y col., 1992; Owens y col., 1990; Silburn y col., 1998) bloquean la infección vírica, presumiblemente formando heteroagregados inactivos. También se ha encontrado que los péptidos correspondientes a las porciones de la hélice N y la hélice C son eficaces inhibiendo la infección vírica tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, un péptido de 17 aminoácidos correspondiente a la porción carboxilo terminal de la hélice N de la proteína de fusión de VIH-1, definida como la región CS3, bloqueaba la infección por VIH (Qureshi y col., 1990) . Además, se ha desarrollado otros péptidos inhibidores de la hélice N y la hélice C en base al modelo estructural de la proteína de fusión (Wild, Greenwell y Matthews, 1993; Wild y col., 1992) , incluyendo el fármaco peptídico anti-hélice C del VIH-1 DP178 (T-20 o FUZEON®) . DP178 se solapa con la hélice C y el dominio proximal aromático de anclaje, e inhibe la fusión virión VIH-1: célula a concentraciones muy bajas (inhibición del 50 % a 1, 7 nM) alcanzables in vivo tras la inyección. En un ensayo clínico, 100 mg/día de DP178 producían una reducción de aproximadamente 100 veces de la carga de VIH-1 en el plasma de los individuos infectados (Kilby y col., 1998) . Este resultado ha motivado en gran medida la búsqueda de otros péptidos inhibidores de VIH-1 en base a la estructura de la proteína de transmembrana (Pozniak, 2001; Sodroski, 1999) . También se ha demostrado que inhibidores peptídicos de paramixovirus inhiben la replicación vírica (Lambert y col., 1996, Young y col., 1999) . Los estudios realizados por Watanabe y colaboradores sugieren que una estrategia similar dirigida hacia la hélice N y la hélice C de GP2 de EboV puede también llevar a descubrir inhibidores útiles (Watanabe y col., 2000) . También se ha demostrado que los anticuerpos neutralizantes dirigidos frente a dominios de proteínas de fusión inhiben la fusión virión: célula.

Observaciones realizadas... [Seguir leyendo]

1. Un péptido inhibidor de la fusión vírica aislado seleccionado entre el grupo compuesto por:

a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1,

b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,

c) un análogo de péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesto por la SEC ID n.º 1 que incluye una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de SEC ID n.º 1, y

d) un péptido análogo que tiene una secuencia de aminoácido compuesto por 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1 que incluye una u más sustituciones de aminoácidos conservadoras y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a los de la secuencia de los 8 o más restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID n.º 1,

para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus.

2. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus en el que el péptido es un análogo de péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID n.º 30.

3. Un péptido según se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo tbutiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino terminal del péptido.

4. Un péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxilo terminal del péptido.

5. El péptido de la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus en el que la infección por arenavirus es una infección por el virus de Lassa.

6. Uso de un péptido según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.

7. El uso de la reivindicación 6 en el que la infección por arenavirus es una infección por el virus de Lassa.

8. Una molécula de ADN recombinante que permite o estimula a un paciente a producir el péptido definido en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus en un paciente.

9. Uso de una molécula de ADN recombinante que permite o estimula a un paciente a producir el péptido definido en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.

10. Un agente que inhibe la fusión vírica que comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos compuesta por 8 a 50 restos de aminoácidos para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de un péptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

11. El agente inhibidor de la fusión vírica según se define en la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo tbutiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino terminal del mismo.

12. El agente inhibidor de la fusión vírica según se define en la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de una infección por arenavirus que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxilo terminal del mismo.

13. Uso de un agente inhibidor de la fusión vírica de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 para la preparación de un medicamento para tratar una infección por arenavirus en un paciente.