Método para prevenir la fusión virus: célula mediante la inhibición de la función de la región de iniciación de la fusión en virus de ARN que tienen proteínas de la envuelta fusogénicas de membrana de clase I.

Péptido inhibidor de la fusión viral aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 7;

(b) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en 8 o más residuos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO:6; y

(c) un análogo peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO:6 que incluye una o 10 más sustituciones de aminoácido conservativas;

para su uso en el tratamiento de una infección paramixoviral.

Metodo para prevenir la fusion virus: celula mediante la inhibicion de la funcion de la region de iniciacion de la fusion en virus de ARN que tienen proteinas de la envuelta fusogenicas de membrana de clase I

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense con numero de serie 60/517.181, presentada el 4 de noviembre de 2003.

Campo de la invención La presente invencion se refi ere a p eptidos para su us o en la prevencion o i nhibicion de la i nfeccion viral p or un paramixovirus de una celula (previniendo de ese modo la insercion del genoma viral en el citoplasma celular, una etapa requerida para la infeccion viral) . La presente invencion preve composiciones y usos de los mismos para prevenir la infeccion por un paramixovirus interfiriendo en su region de iniciacion de la fusion (FIR, fusion inhibiting

region) .

Introducción Todos los virus deben unirse a, e invadir, sus celulas diana para replicarse. Para virus de animales con envuelta, incluyendo virus de ARN que tienen proteinas de fusion de membrana de clase I (virus de tipo I) , el proceso implica (a) la union del virion a la celula diana, (b) la fusion de la envuelta del virus con la membrana plasmatica o una membrana celular interna, (c) la desestabilizacion de la envuelta viral y la membrana celular en la zona fusionada para crear un poro de fusion, (d) la transferencia del ARN viral a traves del poro y (e) la modificacion de la funcion celular por el ARN viral.

La fusion de la membrana viral y la envuelta de la celula, etapas (b) y (c) anteriores, esta mediada por la interaccion de una glicoproteina transmembrana viral (proteina de fusion) con proteinas de superficie y membranas de la celula diana. Estas interacciones provocan cambios conformacionales en la proteina de fusion que dan como resultado la insercion de un peptido de fusion viral en la membrana de la celula diana. Esta insercion va seguida por cambios conformacionales adicionales dentro de la proteina de fusion que llevan la envuelta viral y las membranas celulares a una estrecha proximidad y da como resultado la fusion de las dos bicapas de membrana. Un virus no puede diseminarse y propagarse dentro de su huesped si se altera este proceso de fusion. La alteracion intencionada de este proceso de fusion puede lograrse mediante el direccionamiento de peptidos y peptidomimeticos homologos a secuencias de proteinas de fusion, anticuerpos que reconocen la proteina de fusion, y otros factores que actuan contra la proteina de fusion.

Antecedentes de la invención Similitudes estructurales entre proteinas de fusion de clase I de virus de ARN. La hemaglutinina 2 (HA2) del virus influenza, un ortomixovirus, es la proteina de fusion de clase I de virus de ARN prototipica y contiene un dominio hidrofobo amino-terminal, denominado peptido de fusion, que se expone durante la escision de la proteina precursora de hemaglutinina. Las proteinas de fusion de membrana de virus de AR N de 45 varias fam ilias divers as, incl uyendo arenavirus, coro navirus, filovir us, ortomix ovirus, paramixovirus y retrovirus, comparten varias caracteristicas estructurales comunes con la HA2 y se han denominado proteinas de fusion virales de clase I. Se ha observado que la proteina de fusion del VIH-1, la glicoproteina transmembrana y otras proteinas transmembrana retrovirales, como las de los ortomixovirus y par amixovirus, presentan un dominio de pe ptido de fusion hidrofobo expuesto durante la escision de un precursor (gp160) (Gallaher, 1987; Gonzalez-Scarano et al., 1987) . Basandose en estas similitudes y algoritmos informaticos que predicen configuraciones de proteinas, se ha sugerido (Gal laher et al., 1 989) q ue la parte e xterna (ectodominio, extremo am ino-terminal) d e la protein a transmembrana de VIH-1 y las proteinas transmembrana de otros retrovirus, podria ajustarse en su totalidad al andamiaje de la estructura de HA2 tal como se determino mediante cristalografia de rayos X (Wilson, Skehel y Wiley, 1981) .

Basandose en estas observ aciones, se pr edijo qu e las proteinas tran smembrana re trovirales co ntienen varias caracteristicas estructurales ademas del p eptido de fusi on en comun con la estruct ura conocida de la HA 2, que incluye una helice amino-terminal extendida (N-helice, habitualmente una "repeticion de heptada" o "cremallera de leucina") , una helice carboxilo-terminal (C-helice) y un motivo aromatico proximal al dominio transmembrana. La presencia de al menos cuatro de estos cinco dominios define una proteina de la envuelta viral como proteina de fusion de cl ase I. Este mode lo d e pr oteina transm embrana retrov iral se c onfirmo poster iormente me diante determinaciones estructurales y analisis mutacionales (Chan et al., 1997; Kowalski et al., 1991; Weissenhorn et al., 1997) . Estan presentes motivos estructurales comunes no solo en proteinas de fusion de ortomixovirus y retrovirus, sino tambien en las de paramixovirus, filovirus (tales como el virus del Ebola, VEbo) (Gallaher, 1996) y arenavirus 65 (Gallaher, DiSimone y Buchmeier, 2001) . El modelo estructural de Gallaher de la proteina de fusion de VEbo (GP2) tambien se ha conformado mediante metodos de cristalografia de rayos X (Malashkevich et al., 1999; Weissenhorn et al., 1998) .

La figura 1 muestra los cinco dominios, descritos previamente, de las proteinas de fusion de las seis familias de virus de tipo I. Las proteinas de fusion se originan en un peptido de fusion hidrofobo, terminan en un peptido de anclaje e incorporan un a helic e alfa amino-terminal exten dida (N-helice, hab itualmente una "repeticion d e heptad a" o "cremallera de leucina") , una helice alfa carboxilo-terminal (C-helice) (Carr y Kim, 1993; Suarez et al., 2000; Wilson, Skehel y Wiley, 1981) , y a veces un motivo aromatico proximal a la envuelta del virion. Tambien se muestra el sexto dominio, la region de iniciacion de la fusion (FIR) , descubierto por los presentes inventores.

Inhibicion de la fusion en virus de tipo I

Los inte ntos previ os de lo s presentes i nventores (Ga rr y ) y otros p ara disefar peptidos y pe ptidomimeticos, anticuerpos, y otros factores que inhiben la fusion en virus de tipo I se han centrado en el peptido de fusion, la Nhelice y la C-helice de las proteinas de fusion. En el caso de peptidos de fusion, se ha encontrado que analogos de 15 los ortomixovirus y paramixovirus (Richardson, Scheid y Choppin, 1980) y dominios de peptidos de fusion de VIH-1 (Gallaher et a l., 1992; O wens et al., 199 0; Silbur n et al., 199 8) bl oquean l a infec cion vir al, pre sumiblemente formando heteroagregados inactivos. Tambien se ha encontrado que peptidos correspondientes a partes de la Nhelice y la C-helice son eficaces en la inhibicion de infeccion viral tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, un peptido de 1 7 am inoacidos c orrespondiente a l a p arte carb oxi-terminal de la N-helice d e l a p roteina de fus ion d e VIH-1, definida como la region CS3, bloqueaba la infeccion por VIH (Qureshi et al., 1990) . Ademas, se desarrollaron otros peptidos in hibidores d e N-h elice y C-helice basa ndose en el mod elo estructural d e proteinas de fusion (W ild, Greenwell y Matthews, 1993; Wild et al., 1992) , que incluyen el farmaco peptidico anti-VIH-1 de C-helice DP178 (T20 o FUZEON®) . El DP178 se solapa con la C-helice y el dominio proximal de anclaje aromatico e inhibe la fusion virion:celula de VIH-1 a conc entraciones muy bajas (inhibicion del 50% a 1, 7 nM) q ue pueden conseguirse in viv o tras in yeccion. En un e nsayo clinico, 100 mg/dia de DP178 provocaron un a red uccion d e apr oximadamente 1 00 veces e n p lasma de la c arga de VIH-1 d e ind ividuos infectados (K ilby et al., 19 98) . Este resulta do ha motiv ado enormemente la bus queda de otros p eptidos i nhibidores de VIH-1 basa dos e n la estructura de prot einas transmembrana (Pozn iak, 2 001; So droski, 1999) . T ambien se ha mostrado qu e inhibidores peptidic os de paramixovirus inhiben la replicacion viral (Lambert et al., 1996; Young et al., 19 99) . Wild et al., (1997) describe la inhibicion de la infeccion por el virus del sarampion yla fusion con peptidos sinteticos correspondientes a la region de cremallera de leucina de la proteina de fusion en el virus del sarampion. Estudios de Watanabe y colaboradores sugieren que un enfoque similar de direccionamiento de la N-helice y la C-helice de la GP2 de VEbo tambien puede conducir a inhibidores utiles (W atanabe et al., 200 0) . Tambien se ha mostrado que antic uerpos neutralizantes dirigidos contra partes de los dominios de proteinas de fusion inhiben la fusion virion:celula.

Observaciones en VIH-1

Se ha dedicado una gran cantidad de estudio a la inhibicion de la fusion en el virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1, uno de los virus de ARN de tipo I. Bolognesi et al. (documento 5.464.933) y los... [Seguir leyendo]

1. Peptido inhibidor de la fusion viral aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos que consiste en SEQ ID NO: 7;

(b) un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos que consiste en 8 o mas residuos de aminoacido contiguos de SEQ ID NO:6; y

(c) un analogo peptidico que tiene una secuencia de aminoacidos que consiste en SEQ ID NO:6 que incluye una o mas sustituciones de aminoacido conservativas;

para su uso en el tratamiento de una infeccion paramixoviral.

2. Peptido segun la r eivindicacion 1, par a su uso e n el tratamiento de una infeccion paramixoviral, que i ncluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo, un grupo hidrofobo o un grupo macromolecular en el extremo amino-terminal del peptido.

3. Peptido se gun un a cua lquiera d e las rei vindicaciones 1 y 2 p ara su uso en el tra tamiento d e u na infecc ion paramixoviral, que incluye un grupo amido, un grupo hidrofobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxiloterminal del peptido.

4. Peptid o se gun l a reiv indicacion 1, p ara su uso en el t ratamiento d e una infeccion paramixoviral, en e l q ue l a infeccion paramixoviral es una infeccion por virus del sarampion. 25

5. Peptido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de una infeccion paramixoviral donde la infeccion paramixoviral se selecciona del grupo que consiste en paperas, moquillo, y la enfermedad de Newcastle.

6. Uso de unpeptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparacion de un medicamento 30 para tratar una infeccion paramixoviral en un paciente.

7. Uso segun la reivindicacion 6, en el que la infeccion paramixoviral es una infeccion por virus del sarampion.

8. Molecula de ADN recombinante que permite que, o estimula a, un paciente para que produzca el peptido segun la 35 reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de una infeccion paramixoviral en un paciente.

9. Uso de una molecula de ADN recombinante que permite que, o estimula a, un paciente para que produzca el peptido segun la reivindicacion 1 para la preparacion de un medicamento para tratar una infeccion paramixoviral en un paciente.

10. Uso segun la reivindicacion 9, en el que la infeccion paramixoviral es una infeccion por virus del sarampion.

11. Agente de inhibicion de la fusion viral que comprende un peptido que tiene una secuencia de aminoacidos que

consiste en de 8 a 50 resi duos de am inoacido para su uso en el tratamiento de una infeccion paramixoviral, en el 45 que el peptido comprende una secuencia de aminoacidos de un peptido segun la reivindicacion 1.

12. Agente de inhibicion de la fusion viral segun la reivindicacion 11 para su uso en el tratamiento de una infeccion paramixoviral, que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo, un grupo hidrofobo o un grupo macromolecular en el extremo amino-terminal del mismo.

13. Agente de inhibicion de la fusion viral segun la reivindicacion 11, para su uso en el tratamiento de una infeccion paramixoviral, que incluye un grupo amido, un grupo hidrofobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxiloterminal del mismo.

14. Uso de un agente de inhibicion de la fusion viral segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para la preparacion de un medicamento para tratar una infeccion paramixoviral en un paciente.