Método para prevenir la fusión virus: célula mediante la inhibición de la función de la región de iniciación de la fusión en virus de ARN que tienen proteínas de la envuelta fusogénicas de membrana de clase I.

Péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO:

7;

(b) un péptido que consiste en de 8 a 40 residuos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO: 7 y que no incluye losresiduos 65-81 de SEQ ID NO: 21 (secuencia conservada 3 de la proteína transmembrana del virus de lainmunodeficiencia humana 1; CS3 de TM de VIH-1);

(c) un análogo peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 7 que incluye una omás sustituciones de aminoácido conservativas y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a lasecuencia de SEQ ID NO: 7; y

(d) un análogo peptídico que consiste en de 8 a 40 residuos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO: 7 que incluyeuna o más sustituciones de aminoácido conservativas y en el que la mayoría de los residuos del análogo sonidénticos a la secuencia de los 8 a 40 residuos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO: 7; en el que el análogo noincluye los residuos de aminoácido 65-81 de SEQ ID NO: 21;

para su uso en la inhibición de la fusión virus:célula en el tratamiento de una infección retroviral.

Método para prevenir la fusión virus: célula mediante la inhibición de la función de la región de iniciación de la fusión en virus de ARN que tienen proteínas de la envuelta fusogénicas de membrana de clase I

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense con número de serie 60/517.181, presentada el 4 de noviembre de 2003.

Campo de la invención La presente invención se refiere a péptidos para su uso en la prevención o inhibición de la infección viral por un retrovirus de una célula (previniendo de ese modo la inserción del genoma viral en el citoplasma celular, una etapa requerida para la infección viral) . La presente invención prevé composiciones y usos de los mismos para prevenir la infección por un retrovirus interfiriendo en su región de iniciación de la fusión (FIR, fusion inhibiting region) .

Introducción Todos los virus deben unirse a, e invadir, sus células diana para replicarse. Para virus de animales con envuelta, incluyendo virus de ARN que tienen proteínas de fusión de membrana de clase I (virus de tipo I) , el proceso implica (a) la unión del virión a la célula diana, (b) la fusión de la envuelta del virus con la membrana plasmática o una membrana celular interna, (c) la desestabilización de la envuelta viral y la membrana celular en la zona fusionada para crear un poro de fusión, (d) la transferencia del ARN viral a través del poro y (e) la modificación de la función celular por el ARN viral.

La fusión de la membrana viral y la envuelta de la célula, etapas (b) y (c) anteriores, está mediada por la interacción de una glicoproteína transmembrana viral (proteína de fusión) con proteínas de superficie y membranas de la célula diana. Estas interacciones provocan cambios conformacionales en la proteína de fusión que dan como resultado la inserción de un péptido de fusión viral en la membrana de la célula diana. Esta inserción va seguida por cambios conformacionales adicionales dentro de la proteína de fusión que llevan la envuelta viral y las membranas celulares a una estrecha proximidad y da como resultado la fusión de las dos bicapas de membrana.

Un virus no puede diseminarse y propagarse dentro de su huésped si se altera este proceso de fusión. La alteración intencionada de este proceso de fusión puede lograrse mediante el direccionamiento de péptidos y peptidomiméticos homólogos a secuencias de proteínas de fusión, anticuerpos que reconocen la proteína de fusión, y otros factores que actúan contra la proteína de fusión.

Antecedentes de la invención Similitudes estructurales entre proteínas de fusión de clase I de virus de ARN.

La hemaglutinina 2 (HA2) del virus influenza, un ortomixovirus, es la proteína de fusión de clase I de virus de ARN prototípica y contiene un dominio hidrófobo amino-terminal, denominado péptido de fusión, que se expone durante la escisión de la proteína precursora de hemaglutinina. Las proteínas de fusión de membrana de virus de ARN de varias familias diversas, incluyendo arenavirus, coronavirus, filovirus, ortomixovirus, paramixovirus y retrovirus, comparten varias características estructurales comunes con la HA2 y se han denominado proteínas de fusión virales de clase I. Se ha observado que la proteína de fusión del VIH-1, la glicoproteína transmembrana y otras proteínas transmembrana retrovirales, como las de los ortomixovirus y paramixovirus, presentan un dominio de péptido de fusión hidrófobo expuesto durante la escisión de un precursor (gp160) (Gallaher, 1987; Gonzalez-Scarano et al., 1987) . Basándose en estas similitudes y algoritmos informáticos que predicen configuraciones de proteínas, se ha sugerido (Gallaher et al., 1989) que la parte externa (ectodominio, extremo amino-terminal) de la proteína transmembrana de VIH-1 y las proteínas transmembrana de otros retrovirus, podría ajustarse en su totalidad al andamiaje de la estructura de HA2 tal como se determinó mediante cristalografía de rayos X (Wilson, Skehel y Wiley, 1981) .

Basándose en estas observaciones, se predijo que las proteínas transmembrana retrovirales contienen varias características estructurales además del péptido de fusión en común con la estructura conocida de la HA2, que incluye una hélice amino-terminal extendida (N-hélice, habitualmente una “repetición de héptada” o “cremallera de leucina”) , una hélice carboxilo-terminal (C-hélice) y un motivo aromático proximal al dominio transmembrana. La presencia de al menos cuatro de estos cinco dominios define una proteína de la envuelta viral como proteína de fusión de clase I. Este modelo de proteína transmembrana retroviral se confirmó posteriormente mediante determinaciones estructurales y análisis mutacionales (Chan et al., 1997; Kowalski et al., 1991; Weissenhorn et al., 1997) . Están presentes motivos estructurales comunes no sólo en proteínas de fusión de ortomixovirus y retrovirus, sino también en las de paramixovirus, filovirus (tales como el virus del Ébola, VEbo) (Gallaher, 1996) y arenavirus (Gallaher, DiSimone y Buchmeier, 2001) . El modelo estructural de Gallaher de la proteína de fusión de VEbo (GP2) también se ha conformado mediante métodos de cristalografía de rayos X (Malashkevich et al., 1999; Weissenhorn et al., 1998) .

La figura 1 muestra los cinco dominios, descritos previamente, de las proteínas de fusión de las seis familias de virus de tipo I. Las proteínas de fusión se originan en un péptido de fusión hidrófobo, terminan en un péptido de anclaje e incorporan una hélice alfa amino-terminal extendida (N-hélice, habitualmente una “repetición de héptada” o “cremallera de leucina”) , una hélice alfa carboxilo-terminal (C-hélice) (Carr y Kim, 1993; Suarez et al., 2000; Wilson, Skehel y Wiley, 1981) , y a veces un motivo aromático proximal a la envuelta del virión. También se muestra el sexto dominio, la región de iniciación de la fusión (FIR) , descubierto por los presentes inventores.

Inhibición de la fusión en virus de tipo I

Los intentos previos de los presentes inventores (Garr y ) y otros para diseñar péptidos y peptidomiméticos, anticuerpos, y otros factores que inhiben la fusión en virus de tipo I se han centrado en el péptido de fusión, la Nhélice y la C-hélice de las proteínas de fusión. En el caso de péptidos de fusión, se ha encontrado que análogos de los ortomixovirus y paramixovirus (Richardson, Scheid y Choppin, 1980) y dominios de péptidos de fusión de VIH-1 (Gallaher et al., 1992; Owens et al., 1990; Silburn et al., 1998) bloquean la infección viral, presumiblemente formando heteroagregados inactivos. También se ha encontrado que péptidos correspondientes a partes de la Nhélice y la C-hélice son eficaces en la inhibición de infección viral tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, un péptido de 17 aminoácidos correspondiente a la parte carboxi-terminal de la N-hélice de la proteína de fusión de VIH-1, definida como la región CS3, bloqueaba la infección por VIH (Qureshi et al., 1990) . Además, se desarrollaron otros péptidos inhibidores de N-hélice y C-hélice basándose en el modelo estructural de proteínas de fusión (Wild, Greenwell y Matthews, 1993; Wild et al., 1992) , que incluyen el fármaco peptídico anti-VIH-1 de C-hélice DP178 (T20 o FUZEON®) . El DP178 se solapa con la C-hélice y el dominio proximal de anclaje aromático e inhibe la fusión virión:célula de VIH-1 a concentraciones muy bajas (inhibición del 50% a 1, 7 nM) que pueden conseguirse in vivo tras inyección. En un ensayo clínico, 100 mg/día de DP178 provocaron una reducción de aproximadamente 100 veces en plasma de la carga de VIH-1 de individuos infectados (Kilby et al., 1998) . Este resultado ha motivado enormemente la búsqueda de otros péptidos inhibidores de VIH-1 basados en la estructura de proteínas transmembrana (Pozniak, 2001; Sodroski, 1999) . También se ha mostrado que inhibidores peptídicos de paramixovirus inhiben la replicación viral (Lambert et al., 1996; Young et al., 1999) . Estudios de Watanabe y colaboradores sugieren que un enfoque similar de direccionamiento de la N-hélice y la C-hélice de la GP2 de VEbo también puede conducir a inhibidores útiles (Watanabe et al., 2000) . También se ha mostrado que anticuerpos neutralizantes dirigidos contra partes de los dominios de proteínas de fusión inhiben la fusión virión:célula.

Observaciones en VIH-1

Se ha dedicado una gran cantidad de estudio a la inhibición de la fusión en el virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1, uno de los virus de ARN de tipo I. Bolognesi et al. (documento 5.464.933) y los presentes inventores (Garr y , USPN 5.567.805) enseñan que la destrucción celular... [Seguir leyendo]

1. Péptido aislado seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 7;

(b) un péptido que consiste en de 8 a 40 residuos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO: 7 y que no incluye los residuo.

6. 81 de SEQ ID NO: 21 (secuencia conservada 3 de la proteína transmembrana del virus de la inmunodeficiencia humana 1; CS3 de TM de VIH-1) ;

(c) un análogo peptídico que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID NO: 7 que incluye una o más sustituciones de aminoácido conservativas y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a la secuencia de SEQ ID NO: 7; y

(d) un análogo peptídico que consiste en de 8 a 40 residuos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO: 7 que incluye una o más sustituciones de aminoácido conservativas y en el que la mayoría de los residuos del análogo son idénticos a la secuencia de los 8 a 40 residuos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO: 7; en el que el análogo no incluye los residuos de aminoácid.

6. 81 de SEQ ID NO: 21;

para su uso en la inhibición de la fusión virus:célula en el tratamiento de una infección retroviral.

2. Péptido según la reivindicación 1, para su uso en la inhibición de la fusión virus:célula en el tratamiento de una infección retroviral, que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo tbutiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino-terminal del péptido.

3. Péptido según la reivindicación 1 o reivindicación 2 para su uso en la inhibición de la fusión virus:célula en el tratamiento de una infección retroviral, que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxilo-terminal del péptido.

4. Péptido según la reivindicación 1, para su uso en la inhibición de la fusión virus:célula en el tratamiento de una infección retroviral, en el que la infección retroviral es una infección por VIH-1.

5. Uso de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para la preparación de un medicamento para tratar una infección retroviral en un paciente.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que la infección retroviral es una infección por VIH-1.

7. Molécula de ADN recombinante que permite que, o estimula a, un paciente para que produzca el péptido según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una infección retroviral en un paciente.

8. Uso de una molécula de ADN recombinante que permite que, o estimula a, un paciente para que produzca el péptido según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para tratar una infección retroviral en un paciente.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la infección retroviral es una infección por VIH-1.

10. Agente de inhibición de la fusión viral que comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en de 8 a 50 residuos de aminoácido para su uso en el tratamiento de una infección retroviral, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de un péptido según la reivindicación 1.

11. Agente de inhibición de la fusión viral según la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de una infección retroviral, que incluye un grupo acetilo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo amino-terminal del mismo.

12. Agente de inhibición de la fusión viral según la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de una infección retroviral, que incluye un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo macromolecular en el extremo carboxiloterminal del mismo.

13. Uso de un agente de inhibición de la fusión viral según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, para la preparación de un medicamento para tratar una infección retroviral en un paciente.