Método para detectar agentes virales respiratorios en una muestra de ensayo.

Un método para la detección de hMPV en una muestra de ensayo que consiste en:

a) dividir la muestra de ensayo en dos o más muestras;

b) poner en contacto un primera muestra con una primera mezcla de cebadores deamplificación, comprendiendo dicha mezcla una primera y segunda secuencia de ácidonucleico que comprenden SEQ ID Nº 3 y 4 respectivamente y una tercera y cuarta secuenciade ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 5 y 6 respectivamente y/o sus complementos osecuencias que son distintas a las secuencias SEQ ID Nº 3, 4, 5 y 6 por 1 mutación de estas;

c) poner en contacto una segunda muestra con una segunda mezcla de cebadores deamplificación, comprendiendo dicha mezcla una primera y segunda secuencia de ácidonucleico que comprenden SEQ ID Nº 1 y 2 respectivamente y/o sus complementos osecuencias que son distintas a las secuencias SEQ ID Nº 1 y 2 por 1 mutación de estas;

d) someter la primera y segunda muestra, mezcladas con los cebadores de amplificación delos pasos b) y c) respectivamente, a reacciones de amplificación que buscan amplificar lassecuencias diana presentes en la muestra;

e) obtener oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios a partir de cualquier producto deamplificación y permitir que dichos oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios sehibriden con una pluralidad de sondas específicas de la diana y

f) detectar oligonucleótidos o polinucleótidos hibridados.

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención hace referencia a la reivindicación 1 y a la reivindicación 8. También se describe la detección de los virus respiratorios influenza A, influenza B, influenza C, VPI 1, VPI 2, VPI 3, VPI 4A, 4B, adenovirus, VRSh A, VRSh B, coronavirus229, echovirus 30, rinovirus y hBoV. La invención también hace referencia a las reivindicaciones 12 y 13. [0002] También se describe un conjunto de secuencias de ácido nucleico, así como su uso como cebadores de amplificación para hMPV presentes en una muestra de ensayo. La amplificación de hMPV con las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es compatible con la determinación del genotipo hMPV presente en la muestra de ensayo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0003] Las infecciones de las vías respiratorias son una causa importante de morbosidad y mortalidad en todos los grupos de edad pero especialmente en niños jóvenes, sujetos de edad avanzada y pacientes inmunodeprimidos. Los virus causan la mayoría de estas infecciones. [0004] Además de los virus más comunes que provocan infecciones respiratorias, estudios recientes han sugerido que el metapneumovirus humano (hMPV) debería añadirse a la lista de patógenos virales respiratorios humanos en todos los grupos de edad (van den Hoogen et al., 2001, Nat. Med. 7:719-724; Pere et al., 2002, J. Infect. Dis. 185:1660-1663; Boivin et al., 2002, J. Infect. Dis. 186:1330-1334) . [0005] Como ejemplo de un estudio prospectivo, en un análisis de 1.322 niños hospitalizados <2 años de edad en España durante 5 años, se halló que hMPV era el virus más común tras VRSh y rinovirus (García-García et al., 2006, Pediatri. Pulmonol. 41 (9) :863-71) . Las coinfecciones eran frecuentes y clínicamente similares a las infecciones aisladas y a las infecciones de VRSh. Se pueden encontrar datos adicionales en García-García et al., 2006, Arch Dis Child. 91 (4) :290-5. [0006] Últimamente, se ha sugerido una mayor virulencia del genotipo A de hMPV con respecto al B (Vicente et al., 2006, Clin Infect Dis. 42 (12) :e111-3) . Se analizó el espectro clínico de 69 episodios de la infección pediátrica metapneumovirus (55 episodios provocados por el genotipo A y 14 episodios provocados por el genotipo B) y se halló que la diagnosis de neumonía era más común y que el índice de gravedad de la enfermedad (determinado sobre la necesidad de hospitalización, saturación de oxígeno <90% y estancia en la unidad de cuidados intensivos) era más alto para pacientes con la infección del genotipo A de hMPV. La diferente gravedad que se observó podría atribuirse a una virulencia más alta del genotipo A de hMPV (hMPV-A) con respecto al B (hMPV-B) . [0007] Ya se han descrito intentos para la detección simultánea de hMPV y otros agentes virales que afectan a las vías respiratorias (WO2005/038427 y WO2006/070034 constituyen ejemplos representativos) . Una lista completa de los virus respiratorios incluye: Influenza A y B, virus sincitial respiratorio humano (VRSh) A y B, los cuatro serotipos del virus de parainfluenza humana (VPI) y adenovirus, rinovirus, coronavirus, influenza C, así como enterovirus. Además, el conocimiento de virus que provocan infecciones en las vías respiratorias inferiores se ha enriquecido recientemente con la caracterización de un nuevo miembro, Bocavirus Humano (HBoV) (Allander et al., 2005, PNAS

102: 12891-12896) . [0008] Los cebadores de amplificación clásicos para hMPV son L6 y L7, descritos en primer lugar en Van den Hoogen et al., 2003, J. Infect. Dis. 188:1571-1577. Algunos de los ejemplos del estado de la técnica en los que se usa L6 y L7 para la amplificación de hMPV se encuentran en WO2005/038427 y WO2006/070034. [0009] En concreto, WO2005/038427 presenta un método para la amplificación de secuencias diana de virus de las vías respiratorias superiores, método que incluye amplificación por PCR usando múltiples pares de cebadores para PCR. Como cebadores de amplificación para hMPV, se usan los cebadores L6 y L7. [0010] Además, en WO2006/070034, puede llevarse a cabo la amplificación de los virus respiratorios presentes en un muestra antes de la hibridación de los productos de amplificación con sondas específicas de virus. Los cebadores usados para la amplificación de hMPV son de nuevo L6 y L7. [0011] Otras solicitudes de patente del estado de la técnica dirigidas a la detección simultánea de los patógenos virales respiratorios son: [0012] US2007/092871, que describe micromatrices que tienen una pluralidad de secuencias de sondas de oligonucleótidos para la identificación genética de patógenos respiratorios superiores. Por lo que respecta a los cebadores revelados en la solicitud, solo se presentan secuencias correspondientes a un grupo de cebadores para PCR para amplificar muestras de influenza A. [0013] CA2418004, que describe un ensayo para la detección en una muestra de ensayo de ácidos nucleicos de patógenos virales respiratorios clínicamente importantes en un formato múltiple. La mayoría de las secuencias de cebadores de amplificación dispuestas en la solicitud de patente han sido ya descritas por otros, a excepción de aquellas de hMPV, que se describieron inicialmente en la solicitud de patente. Sin embargo, estas secuencias correspondientes a los cebadores de amplificación de hMPV son distintas a las aquí descritas. [0014] WO2005/005658, que revela un método de detección para el coronavirus que provoca el síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) , método basado en un chip que comprende un soporte en el que se inmovilizan las sondas oligonucleótidas. Además del chip, la solicitud de patente revela asimismo algunos cebadores oligonucleótidos para amplificar otros virus respiratorios, incluyendo algunos para la amplificación de metapneumovirus humano. Sin embargo, ningún cebador de amplificación de la solicitud de patente WO2005/005658 se corresponde con los aquí descritos. [0015] WO2004/057021, que revela composiciones y métodos para la detección de virus respiratorios mediante el uso de secuencias de ácido nucleico específicas. [0016] Ninguno de los cebadores de amplificación de hMPV revelados en WO2004/057021 se corresponde con los revelados en la invención aquí descrita. [0017] WO2006/102695, que revela el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real para la detección de organismos contagiosos respiratorios. Aquí se presentan algunas secuencias correspondientes a cebadores así como a sondas anchor (receptoras) y sensor (donadoras) . Por lo que respecta a los cebadores de amplificación correspondientes a HMPV, las secuencias presentadas son distintas a las de la presente invención.

WO2004/096993, que presenta métodos para detectar metapneumovirus en mamíferos en una muestra, en el que el método comprende o bien poner en contacto la muestra con una sonda de ácido nucleico, o bien poner en contacto la muestra con un anticuerpo, o de forma alternativa, la amplificación del ácido nucleico de MPV de la muestra. Por lo que respecta a este último método de detección, generalmente se manifiesta que los cebadores de amplificación pueden hibridarse de forma específica con la secuencia de ácido nucleico del ADN de metapneumovirus humano, sin aportar ninguna de las secuencias de cebadores específicas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0019] El problema que ha de solucionarse con la presente invención es la provisión de un método que permita una detección de hMPV en una muestra de ensayo alternativa o más eficaz que los métodos del estado de la técnica. Preferentemente, el método debería ser compatible con la posterior clasificación del hMPV presente y con la detección de otros virus respiratorios presentes en la muestra. [0020] La solución, que se corresponde con un primer aspecto de la presente invención, se basa en una o más secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia seleccionada del grupo que comprende SEQ ID nº 1-6, sus complementos y equivalentes y con su uso como cebadores de amplificación en la amplificación de hMPV. Mediante equivalentes se hace referencia a secuencias que pueden ser distintas a la secuencia dada, por ejemplo, por al menos una, preferiblemente una, dos, tres, cuatro mutaciones incluyendo alteraciones, supresiones e inserciones. Otros equivalentes pueden ser cebadores que incorporen nucleótidos modificados o alternativos en lugar de nucleótidos canónicos, siempre que la secuencia equivalente pueda actuar como cebadores de amplificación en la amplificación de hMPV. El ácido nucleico incluye, por ejemplo, ADN, ARN y APN y cualquier otra forma o modificación. Por lo tanto, la invención hace referencia a la reivindicación 1. [0021] Las secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias SEQ ID nº 1 y 2 y las secuencias SEQ ID nº 3 y 4... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de hMPV en una muestra de ensayo que consiste en: a) dividir la muestra de ensayo en dos o más muestras; b) poner en contacto un primera muestra con una primera mezcla de cebadores de amplificación, comprendiendo dicha mezcla una primera y segunda secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 3 y 4 respectivamente y una tercera y cuarta secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 5 y 6 respectivamente y/o sus complementos o secuencias que son distintas a las secuencias SEQ ID Nº 3, 4, 5 y 6 por 1 mutación de estas; c) poner en contacto una segunda muestra con una segunda mezcla de cebadores de amplificación, comprendiendo dicha mezcla una primera y segunda secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 1 y 2 respectivamente y/o sus complementos o secuencias que son distintas a las secuencias SEQ ID Nº 1 y 2 por 1 mutación de estas; d) someter la primera y segunda muestra, mezcladas con los cebadores de amplificación de los pasos b) y c) respectivamente, a reacciones de amplificación que buscan amplificar las secuencias diana presentes en la muestra; e) obtener oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios a partir de cualquier producto de amplificación y permitir que dichos oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios se hibriden con una pluralidad de sondas específicas de la diana y f) detectar oligonucleótidos o polinucleótidos hibridados.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que los oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios se obtienen al desnaturalizar cualquier oligonucleótido o polinucleótido bicatenario presente en los productos de amplificación.

3. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 en el que la pluralidad de sondas específicas de la diana comprende una o más secuencias elegidas del grupo formado por SEQ ID Nº 9, 10, 11, 12 y 13, sus complementos y secuencias que son distintas a ellas por 1 mutación de estas.

4. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que: -los productos de amplificación, obtenidos con la primera mezcla de los cebadores de amplificación que comprenden la primera y segunda secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 3 y 4 respectivamente y la tercera y cuarta secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 5 y 6 respectivamente, o sus complementos y secuencias que son distintas a ellas por 1 mutación de estas, se hibridan con sondas específicas de la diana que comprenden una o más sondas elegidas del grupo que comprenden SEQ ID Nº 11 a 13, y

-los productos de amplificación, obtenidos con la segunda mezcla de los cebadores de amplificación que comprenden la primera y segunda secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 1 y 2 respectivamente, o sus complementos y secuencias que son distintas a ellas por 1 mutación de estas, se hibridan con sondas específicas de la diana que comprenden una o más sondas elegidas del grupo que comprenden SEQ ID Nº 9 y 10.

5. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 en el que la segunda mezcla de cebadores de amplificación comprende los cebadores de SEQ ID Nº 7 y 8.

6. Un kit para la detección e identificación en una muestra de ensayo de hMPV, en el que dicho kit comprende dos o más mezclas de amplificación, -Una primera mezcla que comprende una primera y segunda secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 3 y 4 respectivamente y una tercera y cuarta secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 5 y 6 respectivamente o sus complementos y secuencias que son distintas a las secuencias de SEQ ID Nº 3, 4, 5 y 6 por 1 mutación de estas, como componentes de un par de cebadores de amplificación para hMPV; y

-Una segunda mezcla que comprende una primera y segunda secuencia de ácido nucleico que comprenden SEQ ID Nº 1 y 2 respectivamente o sus complementos y secuencias que son distintas a las secuencias de SEQ ID Nº 1 y 2 por 1 mutación de estas, como componentes de otros pares de cebadores de amplificación para hMPV.

7. Kit de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la segunda mezcla de cebadores de amplificación comprende además cebadores que comprenden las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID Nº 7 y 8.

8. Kit de acuerdo con las reivindicaciones 6 y 7, que permiten además la detección de la influenza A, influenza B, influenza C, VPI 1, VPI 2, VPI 3, VPI 4A, 4B, adenovirus, VRSh A, VRSh B, coronavirus229, echovirus 30, rinovirus y hBoV, en una muestra de ensayo, kit que comprende: -Pares de cebadores que comprenden secuencias de ácido nucleico elegidas del grupo que comprende SEQ ID N.

2. 38 para la influenza A, influenza B, influenza C, VRSh B, adenovirus, echovirus 30, rinovirus y hBoV, dentro de la primera mezcla de amplificación y

-Pares de cebadores que comprenden secuencias de ácido nucleico elegidas del grupo que comprende SEQ ID Nº 14-24 para VPI 1, VPI 2, VPI 3, VPI 4A, 4B, VRSh A y Coronavirus tipo 229, dentro de la segunda mezcla de amplificación.

9. Kit de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, que comprende además: i) un recipiente matriz o un conjunto de recipientes matrices, comprendiendo cada uno una micromatriz en el que se presentan sondas específicas de la diana; y ii) reactivos para utilizarse a la hora de visualizar la hibridación de los ácidos nucleicos con las sondas de la micromatriz.

10. Kit de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las sondas específicas de la diana comprenden una o más secuencias elegidas del grupo formado por SEQ ID Nº 9 a 13, sus complementos y secuencias que son distintas a estas por 1 mutación de estas, como sondas específicas de la diana para hMPV.

11. Kit de acuerdo con la reivindicación 9 y 10, en el que las sondas específicas de la diana están comprendidas en un recipiente matriz individual o en un conjunto de recipientes matrices.

12. Un conjunto de cebadores que comprenden las secuencias de ácido nucleico SEQ ID Nº 1 a 6.

13. Un conjunto de sondas formado por al menos una sonda elegida de SEQ ID Nº 9 y 10 y al menos una sonda elegida de SEQ ID Nº 11 a 13.

Figura 1. Figura 2.