Un método de detección de HSV'-1, HSV-2 y VZV que comprende la amplificación en un único tubo de una muestra que comprende material genético viral con el par de cebadores:

HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG) (SEQ ID Nº 3) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2);

HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) (SEQ ID Nº 4) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2);

y VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA) (SEQ ID Nº 9) y VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 10), para obtener productos de amplificación que comprenden porciones de material genético de HSV-1, HSV-2 yVZV, si se hallan presentes.

Campode la invención [0001] La presente invención hace referencia a un método y kit para la detección e identificación de herpesvirus en una muestra de ensayo, concretamente el HSV-1, HSV-2 y VZV; opcionalmente también puede detectarse el HHV-6 en la muestra. También quedan aquí descritos un método y kit que permiten asimismo la detección eficiente de VZV, CMV, EBV, enterovirus, HHV-7 y HHV-8.

[0002]Se proporcionan distintas combinaciones particularmente ventajosas de cebadores de amplificación.

[0003]También quedan aquí descritos un método y kit para la detección e identificación, en caso de estar presentes en una muestra de ensayo, de uno o más agentes virales del grupo compuesto por HSV-1, HSV-2, HHV-6, VZV, CMV, EBV, Enterovirus, HHV-7 y HHV-8.

Antecedentes de la invención

[0004]Existen más de 100 herpesvirusconocidos pertenecientesa la familia de la Herpesviridae.De estos, se sabe que 8 infectan a humanos: el virus del herpes simple 1 (HSV-1) , el virus del herpes simple 2 (HSV-2) , el virus de la varicela zoster (VZV) , el virus de Epstein-Barr (EBV) , el citomegalovirus (CMV) , el virus del herpes 6 (HHV-6) , el virus del herpes 7 (HHV-7) y el virus del herpes 8 (HHV-8) .

[0005]Los herpesvirus son agentes infecciosos que, tras una infección inicial aguda, establecen una infección latente produciendo recurrencias periódicasen condiciones específicas. La recurrencia de la infección producida por herpesvirus se asocia auna patología neurológica y a alteración.Las manifestaciones clínicas más comunes de las infecciones del sistema nervioso central que se asocian a este grupo de virus son: meningitis aséptica, encefalitis, meningoencefalitis y polirradiculitis.

Además de infecciones neurológicas producidas por herpesvirus, existen otras infecciones neurológicas de origen viral causadas por virus del grupo enterovirus, como se describe en EP0789081. Tanto los enterovirus como los herpesvirus son capaces de producirsíndromes neurológicos, tanto en pacientes inmunocompetentes como en inmunodeprimidos.

[0007]Las técnicas generales de laboratorio para la detección viral comprendenel aislamiento de virus en células cultivadas, técnicas serológicas y detección de material genético por PCR. Estas dos últimas técnicas son lentas y de baja sensibilidad, por lo cual se han centrado los esfuerzos más recientes en esta última técnica.

Los herpesvirus son virus con envoltura cuyo genoma constituye una molécula de ADN bicatenario, mientras que los enterovirus son virus sin cubierta con un genoma formado por una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva.

[0009]Se describen algunos ejemplos de ensayos por PCR múltiplepara la detección de herpesvirus en WO93/25707, WO2004/016219 y US2007/0207453.

EnWO2004/016219 se describe un método para detectar e identificar uno o más herpesvirus en una muestra, donde tal método comprende el uso de cebadores consenso para la secuencia genética de la ADN-polimerasa de los herpesvirus en conservación. La detección e identificación proceden a realizarse mediante análisis de la movilidad de heteroduplos (HMSA por sus siglas en inglés) , prueba dot blot o PCR en tiempo real.

[0011]Asimismo, se describe en EP0789081 un método para detectar algunos virus pertenecientes a la familia de la Herpesviridae (HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, HHV-6 y EBV) y los Enterovirus.

[0012]En EP0789081 se describen mezclas de cebadores de reacción utilizadas para la amplificación enzimática de genomas de virus pertenecientes a la familia de la Herpesviridae, tales como el SV-1, HSV-2, VZV, CMV, HHV-6 o el EBV, así como enterovirus. Los cebadores se utilizan en una reacción múltiple que genera fragmentos de amplificación del mismo tamaño, a partir de los cuales la identificación del agente infeccioso presente en la muestra sólo puede realizarse a través de una segunda reacción de amplificación sobre los productos resultantes de la primera reacción de amplificación, o de otra forma, por hibridación de las secuencias amplificadas con sondas de oligonucleótidos específicas.

[0013]EnWO 2007/056463 se describen métodos y composiciones para ser utilizados en el análisis cuantitativo y simultáneo de dos o más patógenos virales, bacteriales o protozoarios en una muestra. Los métodos de esta invención implican la adición de cebadores de oligonucleótidos específicos para cada patógeno que desea detectarse, junto con moléculas competidoras de ácido nucleico que se amplifican con cebadores específicos de un patógeno a un nivel de eficiencia similar. Markoulatos P et al. (2000, Journal of Clinical Laborator y Analysis, Vol. 14, nº 5, páginas 214-219) describe un método para la detección simultánea de HSV-1, HSV-2 y VZV en una muestra biológica por PCR múltiple. Asimismo, Shin CH et al. (2003, Yonsei Medical Journal, Vol. 44, nº 6, páginas 1001-7) , detalla un método para la detección simultáneade HSV-1, HSV-2, CMV y EBV en una muestra también por PCR múltiple.

[0014]EnUS 2007/0141559 se describe un método para la detección y diferenciación entre HSV-1 y HSV-2 en una muestra mediante la utilización de secuencias de cebadoresespecíficaspara HSV-1 o HSV-2 a través de PCR múltiple o independiente.

[0015]Algunos aspectos de la presente invención se relacionan, además, con métodos para reducir la detección de hibridación cruzada no específica de secuencias diana de ácido nucleico amplificadas, particularmente, aunque no de forma exclusiva, en la ejecución del método de detección tal y como se ha descrito anteriormente.

[0016]EnWO 03/033735 se describe un sistema analítico de tira de ensayo por inmersión que comprende reactivos secos que pueden ser utilizados para detectar la presencia de secuencias específicas de ácido nucleico dentro de una muestra.

[0017]EnWO 2007/032748 se describe un método para la detección de metilación en una muestra de ADN que comprende la conversión química de residuos de citosina no metilada a uracilo, amplificando el ADN convertido químicamente con la utilización de cebadores, de los cuales el cebador superior (upper primer) se biotiniza, e hibridando el producto marcadoa una sonda oligonucleotídica, junto con la adición de estreptavidina.

[0018]En WO99/25867 se describe un método para la detección de ácidos nucleicos en varias muestras, lo cual comprende la preparación de los ácidos nucleicos en la muestra, la eliminación de inhibidores de amplificación, la generación de productos por PCR de secciones del ácido nucleico, y la detección automática de los productos de la amplificación.

EnUS2005/0287549 se describe un método para la detección simultánea de un número de polimorfismos de nucleótido simple (SNP) . Se describe particularmente el uso de un par de cebadores de los cuales el primero es biotinizado.Tras ello, se inmoviliza el producto de amplificaciónmediante reacciones con avidina-biotina.

EnEP0795612 se describe un método para amplificar y detectar un ácido nucleicodiana en una muestra, lo cual comprende seguir un paso de incubación post-amplificación con anterioridad a la detección para inactivar las enzimas de la amplificación. Un producto amplificado con biotina puede entonces ser detectado por hibridación con unconjugado estreptavidina-enzima.

[0021]EnWO 01/094638 se describe un método para la amplificación del ácido nucleico, que incluye un protocolo de termociclado, y el uso de cebadores marcados de avance en el paso de amplificación.

[0022]En EP1595960 se describe un método para la detección selectiva de ácido nucleico en una muestra, lo cual comprende la amplificación del ácido nucleico con dos cebadores, uno de los cuales es biotinizado, y la hibridación del producto marcadocon una sonda de captura.

[0023]EnKR060015668 se describe un método para la detección de microorganismos patógenos, que comprende la amplificación de una secuencia diana con un cebador marcado y la hibridación del producto marcado con sondas inmovilizadas sobre la superficie de un biochip.

[0024]En la base de datos Geneseq (cebador de amplificación genómica del virus de la varicela zoster) (con números de accesoa la base de datos AAT37529 y AAT37524) se describe el uso de al menos un cebador de amplificación en AAT37520-T37522 y en AAT37523-T37532 para la amplificación de las secuencias de enterovirus y herpesvirus.

[0025]Enla base de datos Geneseq (sonda... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección de HSV'-1, HSV-2 y VZV que comprende la amplificación en un único tubo de una muestra que comprende material genético viral con el par de cebadores:

HSV1S-18 (CCTTCGAACAGCTCCTGG) (SEQ ID Nº 3) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2) ;

HSV2S-20 (TCCATTTTCGTTTTGTGCCG) (SEQ ID Nº 4) y HSV1-AS (ATGACGCCGATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 2) ; y VV1S (AAGGTTATATATGGAGATACGGA) (SEQ ID Nº 9) y VV1AS (ATTACCCCAATGTACTTTTTCTT) (SEQ ID Nº 10) , para obtener productos de amplificación que comprenden porciones de material genético de HSV-1, HSV-2 yVZV, si se hallan presentes.

2. El método de la reivindicación 1 que comprende, además, la desnaturalización de los productos de amplificación y la hibridación de los productos con sondas diana específicas.

3. El método de las reivindicaciones 1 y 2, que comprenden: a) La puesta en contacto la muestra con el set de cebadores de amplificación; b) El sometimiento de la muestra de ensayo mezclada con el set de cebadores de amplificación a una

reacción de amplificación del ácido nucleico, con el objeto de que dicha reacción de amplificaciónamplifique las secuencias diana presentes en la muestra; c) La obtenciónde oligonucleótidos monocatenarios a partir de cualquiera de los productos de amplificación; d) La opciónde que los oligonucleótidos monocatenarios del punto c) hibriden con una pluralidad de sondas diana específicas, y e) La detección de oligonucleótidos hibridados.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el cebador HSV1S-18 (SEQ ID Nº 3) no está marcado y el cebador HSV1-AS (SEQ ID Nº 2) sí está marcado, de forma que el producto de amplificación relevante comprenda una cadena de amplificación marcada y una cadena de amplificación sin marcar.

5. El método de la reivindicación 4, que además comprende la desnaturalización de los productos de amplificación y la hibridación de los productos de amplificación con una o más sondas que pueden ser sondas diana o no diana, caracterizado porque la cadena marcada obtenida a partir del cebador marcado HSV1-AS (SEQ ID Nº 2) puede hibridar con una sonda diana específica, y la cadena no marcada obtenida del cebador no marcado HSV1S-18. (SEQ ID Nº 3) puede hibridar con la sonda nodiana (si se halla presente) .

6. Un kit para la detección e identificación de HSV-1, HSV-2 y VZV en una muestra de ensayo, que comprende:

i. Una mezcla de amplificación de ácido nucleico que comprende los pares de cebadores de amplificación HSV1S-18 (SEQ ID Nº 3) y HSV1-AS (SEQ ID Nº 2) , HSV2S-20 (SEQ ID Nº 4) y HSV1-AS (SEQ ID Nº 2) , y VV1S (SEQ ID Nº 9) y VV1AS (SEQ ID Nº 10)

ii. Un recipientede matriz o un set de recipientes de matriz, cada uno con una micromatriz en la que se incluyen sondas diana,

iii. Reactivos para ser utilizados en la visualización de la hibridación de ácidos nucleicos con las sondas de la micromatriz.

7. Un kit según la reivindicación 6, que comprende asimismo los reactivos para la extracción del ácido nucleico y/o su purificación.

8. El kit según las reivindicaciones 6 y 7, donde el par de cebadores constituido por HSV1S-18 y HSV1-AS comprende el cebador no marcado HSV1S-18 (SEQ ID Nº 3) y el cebador marcado HSV1-AS (SEQ ID Nº 2) .

9. El kit de las reivindicaciones 6, 7 y 8, que además incluye, como control interno, los cebadores de amplificación RTS (GCTTGGGCGTGTCTCAAAATCT) (SEQ ID Nº 20) y RTA (GTCGCCACGGTTGATGAGAGCT) (SEQ ID Nº 21) , así como un ácido nucleico susceptible de amplificación por dichos cebadores.

10. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde el recipiente de matriz es un tubo AT.

11. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde el set de recipientes de matriz consiste en una tira AS.

12. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, donde las moléculas sonda de la micromatriz son impresas en un soporte sólido, siendo éste el fondo de un recipiente dematriz.

13. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, donde las moléculas sonda de la micromatriz son impresas en un soporte sólido, el cual se halla fijado en el fondo de un recipiente de matriz.

14. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, donde la micromatriz comprende sondas que se unen a sus correspondientes secuencias diana en las mismas condiciones de hibridación.

15. El uso del método según las reivindicaciones 1 a 5, o el kit según las reivindicaciones 6 a 14, para la detección e identificación, en caso de estar presentes en la muestra de ensayo, de uno o más agentes virales seleccionados del grupo formado porHSV-1, HSV-2 y VZV.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante se incluye únicamente para la comodidad del lector, no formando parte del documento de la patente europea. A pesar del sumo cuidado durante la recopilación de las referencias, no se pueden excluir la presencia de errores u omisiones, declinando la OEP toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción

• EP 0789081 A [0006] [0011] [0012] [0039] [0041][0042] [0046] [0047] [0049] [0056] [0059] [0117][0118] [0120] [0124]

• WO 9325707 A [0009]

• WO 2004016219 A [0009] [0010]

• US 20070207453 A [0009]

• WO 2007056463 A [0013]

• US 20070141559 A [0014]

• WO 03033735 A [0016]

• WO 2007032748 A [0017]

• WO 9925867 A [0018]

• US 20050287549 A [0019]

• EP 0795612 A [0020]

• WO 01094638 A [0021]

• EP 1595960 A [0022]

• KR 060015668 [0023]

• US 2004110195 A [0026]

• EP 1694813 A [0072]

Referencias bibliográficas no pertenecientes a patentes citadas en la descripción

21. 219 [0013] Laborator y Analysis, 2000, vol. 14 (5) .

21. 219 [0035] • SHIN CH et al. Yonsei Medical Journal, 2003, vol.44 (6) .

100. 7 [0013] • SHIN et al. YonseiMedical Journal, 2003, vol. 44 (6) .

100. 7 [0035]