KIT PARA LA DETECCIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO.

La presente invención se basa en una sonda de ADN que permite la detección específica del tipo 33 del virus del papiloma humano (VPH),

al mismo tiempo que evita la detección inespecífica del tipo 31 de VPH.

Asimismo, la presente invención está relacionada con un microarray de sondas de ADN que contiene la sonda de la presente invención, con un Kit de detección de HPV que comprende dicho microarray, así como con el uso de la sonda de ADN, del microarray o del kit que la contienen, para la detección del tipo 33 de VPH en una muestra.

Kit para la detección del virus del papiloma humano.

Antecedentes de la invención

El virus del papiloma humano (VPH) es uno de los agentes etiológicos del cáncer de cérvix (cuello de útero) y produce la enfermedad de transmisión sexual más común entre mujeres (Bosch et al., 1995, J. Natl. Cancer Inst., 87: 796-802) . En los últimos años se ha determinado que la infección con el VPH es la principal causa de cáncer de cuello de útero y de neoplasia cervical intraepitelial (Walboomers et al., 1999, J. Path., 189:12-19; Bosch et al., 2002, J. Clin. Pathl., 55: 244-265) .

Cerca de 30 tipos de VPH se transmiten por medio del contacto sexual, y producen infección anogenital, clasificándose en dos grupos de riesgo según su asociación con el cáncer de cuello de útero (Dunne et al., 2007, JAMA, 297 (8) ; Muñoz et al., 2003, N. Engl. J. Med., 348 (6) : 518-527) : Tipos de alto y bajo riesgo oncogénico. Una correcta identificación de los tipos de VPH causantes de la infección es fundamental para poder determinar el tratamiento médico adecuado.

De entre todos los tipos de VPH, los que presentan la tasa de malignicidad más elevada son el 16, 18, 31 y 33 (Berkhof et al., 2006, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 15 (7) : 1268-73) . Además, todas las evidencias epidemiológicas apuntan a que existe una relación directa entre estos tipos de VPH y el desarrollo del cáncer de cuello de útero (IARC Monographs on the evaluation of carcinogenics risk to humans. Human Papillomaviruses. Vol. 90. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2007) .

Otros estudios indican que los tipos 31 y 33 son, junto con los tipos 16 y 18, de los más abundantes en casos de HSIL (high-grade squamous intraepithelial lesions) y SCC (squamous cell carcinoma of the cervix) (Clifford et al., 2003, British Journal of Cancer 89, 101-105) .

Las técnicas moleculares más empleadas y más sensibles para la detección de VPH están basadas en la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR; Las dos reacciones de PCR consenso más comunes empleadas son las llamadas MY-PCR y su variante PG-MY, que contienen el conjunto de cebadores de amplificación MY11, MY09 y HMB01 (Manos et al., 1989, Cancer Cells, 7:209-214.; Hildesheim et al., 1994, J. Infect. Dis., 169: 235-240; Gravitt et al., 2000, J. Clin. Microbiol., 38 (1) : 357-361) , y la llamada GP-PCR, que contiene el conjunto de cebadores GP5+/GP6+ (de Roda et al., 1995, J. Gen. Virol., 76:1057-1062; Jacobs et al., 1995, J. Clin. Microbiol., 33: 901-905; Jacobs et al., 1997, J. Clin. Microbiol., 35:791-795) .

Una vez que se ha detectado la presencia de VPH mediante una reacción de amplificación, se crea la necesidad de tiparlo; Para ello se han utilizado a lo largo del tiempo diferentes técnicas que van desde la secuenciación, pasando por el análisis con enzimas de restricción, y finalmente técnicas basadas en la hibridación de los productos de PCR con sondas complementarias depositadas en diferentes superficies (Jacobs et al., 1995, J. Clin. Microbiol., 33: 901-905) .

Un método de diagnóstico y tipado de VPH fundamental dentro del estado de la técnica, es el descrito en WO2007017699. En él se lleva a cabo una reacción de amplificación PCR basada en los cebadores MY-PCR, seguida de tipado mediante hibridación del producto de PCR con un microarray de sondas específicas para una gran variedad de tipos de VPH, tanto de alto como de bajo riesgo oncogénico.

Estudios llevados a cabo con muestras reales a las que se sometió al método de detección de WO2007017699, revelaron que se producían hibridaciones inespecíficas del amplificado correspondiente al genotipo 31 de VPH sobre la sonda correspondiente al 33. De este modo, muestras que aparentemente contenían tanto el genotipo 31 como el 33 de VPH, cuando se analizaban mediante nested-PCR y/o secuenciación, resultaban contener sólo el tipo 31.

Las secuencias de las sondas originales para detección del producto de PCR correspondiente al tipo 33 son:

TABLA 1

El análisis de los alineamientos entre el genotipo 31 y las sondas correspondientes al genotipo 33 no justificaba la hibridación cruzada que se observaba en la realidad entre ambos (Figura 1) , al no presentar una identidad entre las secuencias que hiciera obvia para un experto en la materia la existencia de una posible hibridación; Por ese motivo, la información técnica de que se disponía no aportaba ninguna indicación acerca de cómo resolver el problema de la hibridación cruzada.

Descripción de la invención

Había, por tanto, que resolver el problema de la hibridación inespecífica del genotipo 31 con la sonda correspondiente al 33.

La solución a ese problema la aportó la sonda de ADN según la reivindicación Nº 1, la sonda de secuencia SEQ ID NO 3.

Con la sonda de ADN según la reivindicación Nº 1 (Sonda de secuencia SEQ ID NO 3, Tabla 2) , se ha conseguido evitar la hibridación inespecífica con VPH del tipo 31, así como hibridaciones inespecíficas con otros tipos de VPH de secuencia similar, al mismo tiempo que se consigue una hibridación específica con VPH de tipo 33.

Con otras sondas de nuevo diseño, diseñadas siguiendo el mismo criterio que para el diseño de la sonda de secuencia SEQ ID NO 3 (Sondas de secuencias SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7 de la Tabla 2) , se conseguía evitar la hibridación inespecífica de VPH del tipo 31 que tenía lugar con las sondas originales de secuencias SEQ ID NO1ySEQ ID NO 2, pero se perdía la capacidad para detectar el propio VPH de tipo 33.

TABLA 2

El hecho de que con las sondas de secuencias SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7 no se consiga detectar VPH de tipo 33 no es debido a motivos de secuencia, dado que un análisis in silico arroja datos de una perfecta complementariedad entre dichas sondas y la secuencia de ADN de HPV de tipo 33 (Figura 2) .

Además, tanto la sonda de secuencia SEQ ID NO 3 de la presente invención, como las sondas de secuencias SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, y SEQ ID NO 7, presentan unas características similares entre sí, tanto en cuanto a longitud (número de nucleotidos, nt) , como a parámetros como el de la Temperatura de Melting (Tm) , porcentaje de GC, y otros parámetros termodinámicos.

Por tanto, nada hacía evidente, ni a la vista de los alineamientos de la Figura 2, ni a la vista de las características de las distintas sondas de nuevo diseño (Tabla 2) , que la única sonda que conseguiría evitar la hibridación inespecífica del tipo 31, y de otros tipos de VPH de secuencia similar, y a la vez fuera capaz de detectar el propio tipo 33, sería la sonda de secuencia SEQ ID NO 3 de la presente invención.

Además, la sonda de secuencia SEQ ID NO 3 es muy similar a la sonda original de secuencia SEQ ID NO 2 (ver Tablas 1 y 2) , y sin embargo, a diferencia de ella, no se produce hibridación de la misma con VPH de tipo 31.

Los inventores de la presente invención han comprobado que ligeras variaciones en la longitud de la sonda de secuencia SEQ ID NO 3, en particular, variaciones de 1, 2, 3 o más nucleotidos, afectan de manera significativa a las características funcionales de la sonda de secuencia SEQ ID NO 3.

Un primer aspecto de la presente invención consiste pues en la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de dicha sonda de ADN para llevar a cabo la detección del tipo 33 de VPH.

La sonda de la presente invención puede encontrarse formando parte de un microarray de sondas de ADN, el cual puede contener sondas específicas para la detección de uno o más tipos de VPH, y cuya finalidad es la detección y el tipado de VPH presente en una muestra.

Otro aspecto de la presente invención es un Kit para la detección de uno o más tipos de VPH, que contiene un microarray que a su vez contiene la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3.

Descripción de las figuras

Figura 1

La figura 1 muestra un alineamiento de las secuencias de ADN correspondientes a los tipos 31 y 33 de HPV. En ella se señala la posición en la que hibridan las sondas de secuencias SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2, diseñadas para detección específica del tipo 33. Asimismo, se indica la posición en la que hibridan las sondas de secuencias SEQ ID... [Seguir leyendo]

1. Sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3.

2. Uso de la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3 para llevar a cabo la detección del tipo 33 de VPH.

3. Microarray de sondas para detección de uno o más tipos de VPH, caracterizado en que el microarray contiene la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3.

4. Microarray según la reivindicación 3, que contiene, además de la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3 para detección de VPH de tipo 33, al menos una de las sondas de secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9, para detección de VPH del tipo 31.

5. Kit para la detección de uno o más tipos de VPH, que contiene un microarray de acuerdo con la reivindicación

3.

6. Kit de detección según la reivindicación 4, en el cual el microarray contiene, además de la sonda de ADN de secuencia SEQ ID NO 3 para detección del tipo 33 de VPH, al menos una de las sondas de secuencias SEQ ID NO 8 y SEQ ID NO 9, para detección de VPH del tipo 31.

7. Kit de detección según las reivindicaciones4y5, que contiene, además del microarray de sondas, una mezcla de reactivos para la amplificación del ADN presente en la muestra a analizar y/o reactivos para la visualización de la hibridación entre el producto amplificado y las sondas del microarray.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> GENOMICA S.A.U.

<120> Kit para la detección del virus del papiloma humano.

<130>

<140>

<141> 2010-03-24

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> 33B1-AS

<400> 1

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> 33A2

<400> 2

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> T33A2.1-A-AR

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> T33B1.2-A-AR

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> T33B1.3-A-AR

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> T33B1.4-A-AR

<400> 6

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> T33B1.5-A-AR

<400> 7

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223.

31. AS

<400> 8

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> 31B5

<400> 9