Método de pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón de estadio I o II.

Método de pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón de estadio I o II.

La presente invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos Útiles para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II caracterizado por la detección y/o cuantificación de perfil de expresión génica de 50 biomarcadores. También se refiere a un método in vitro de pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II que comprende la detección y/o cuantificación de perfil de expresión génica de 50 biomarcadores. Además también se refiere al kit que comprende las sondas capaces de detectar dichos biomarcadores y su uso para la obtención de datos útiles para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadios I y II.

Método de pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón de estadio I o II.

La presente invención se refiere a un método in vitro de pronóstico en carcinoma no microcítico de pulmón de estadios I

o II basado en la expresión diferencial de 50 genes. Mediante el método de la invención se diferencian pacientes con buen pronóstico y pacientes con mal pronóstico. La presente invención también se refiere a un kit que comprende un conjunto de sondas que reconocen los 50 genes de la invención. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer con una tasa anual de más de 1, 1 millones de personas en todo el mundo, y con una tasa de supervivencia a cinco años de sólo el 15%. Aproximadamente el 80% de los casos diagnosticados se clasifican como carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) y el 20% restante corresponden a carcinoma microcítico de pulmón (CMP) . En el CNMP, los tipos más frecuentes son el carcinoma epidermoide o escamoso y el adenocarcinoma.

El sistema de estadiaje TNM (7ª edición) basado en el tamaño del tumor (T) , la afectación ganglionar (N) y la presencia de metástasis a distancia (M) es, en la actualidad, el factor pronóstico más utilizado en los pacientes con CNMP. En función de estos parámetros, los tumores se clasifican en: estadio I y estadio II (en ambos casos la enfermedad es localizada) , estadio III (enfermedad localmente avanzada) y estadio IV (enfermedad metastásica) (Kligerman S. Amerian Journal of Roentgenology 2010. 194:562-573) .

En estadios iniciales o tempranos (estadios I y II) , la cirugía con intención curativa es el tratamiento de elección encontrándose en continua discusión el beneficio de la quimioterapia adyuvante para disminuir la elevada tasa de recurrencia posterior a la resección quirúrgica que oscila entre un 30-35% de los pacientes. En concreto, en estadios II, la quimioterapia adyuvante basada en platinos, como el cisplatino, ha demostrado mejorar la supervivencia de determinados subgrupos pero, por otro lado, existe un porcentaje de pacientes que a pesar de no recaer tras la cirugía reciben tratamiento adyuvante y que son por lo tanto pacientes tratados en exceso. Este sobretratamiento repercute en problemas en estos pacientes asociados a los efectos secundarios de dichos tratamientos. Respecto a los estadios I (que engloba a los subgrupos IA y IB) , y según la guía de consenso elaborada por el “National Comprehensive Cancer Network” (NCCN) en 2011, en el subgrupo IA la quimioterapia adyuvante no está indicada, mientras que en los pacientes del subgrupo IB, sólo está recomendada en aquellos que cumplan factores de riesgo como pobre grado de diferenciación, invasión vascular, resección en cuña y márgenes mínimos. Por lo tanto, debido a la falta de precisión de los métodos actuales para definir el pronóstico de los estadios tempranos del CNMP, en la actualidad existen pacientes que reciben un tratamiento adyuvante que no les beneficia y también pacientes que no reciben un tratamiento adyuvante y que sin embargo tienen una alta probabilidad de recurrencia del tumor.

Actulamente, en el cáncer de pulmón no se conocen marcadores de probado valor pronóstico y predictivo que indiquen cúal será la progresión del paciente (Karapaniagiotou E, et al. Open Lung Cancer J 2009. 2: 24-30) . En CNMP se han desarrollado estudios que utilizan plataformas de análisis masivo para la obtención de perfiles de expresión génica que puedan ser utilizadas como biomarcadores pronóstico. Los resultados obtenidos han sido dispares en cuanto a los genes a incluir en el biomarcador, quizás debido al uso de criterios diferentes en cuanto a la inclusión de pacientes en el estudio, la obtención de muestras, la elección de los estadios tumorales, la exclusión o no de subtipos histológicos de gran importancia en el CNMP, así como a la falta, en algunos casos, de validación independiente (Roepman P. et al. Clin Cancer Res 2009. 15:284-290; Chen HY et al. New Engl J Med 2007. 356 (1) :11-20) ; Raponi M et al. Cancer Res 2006 66:7466-7472; US20090062144; WO2010007093; Raz DJ et al. Clin Cancer Res 2008 14 (17) :5565–5570) .

Por lo tanto existe la necesidad de desarrollar una herramienta alternativa que pueda ser usada clínicamente, que sea más efectiva que los factores de riesgo estándar en identificar aquellos pacientes completamente resecados y clasificados como estadio I que puedan beneficiarse de la quimioterapia adyuvante y que además permita identificar aquellos pacientes clasificados como estadios II que tengan bajo riesgo de recurrencia y en los que la quimioterapia no sería necesaria. Se requiere por lo tanto un método robusto que sea capaz de estratificar pacientes con CNMP en grupos de buen y mal pronóstico.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar un método in vitro alternativo que determine el pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) en estadios iniciales para la obtención de un tratamiento personalizado del paciente.

En la presente invención se describe un método in vitro para el pronóstico de CNMP tanto de estadio I como de estadio II que se caracteriza por la detección y/o cuantificación de un producto de expresión del conjunto de 50 genes, que se muestran en la tabla 1 en la muestra biológica de un sujeto. La presente invención también se refiere al uso de los productos de expresión de dichos 50 genes como biomarcadores pronóstico de cáncer de CNMP de estadios I o II.

El método de la invención proporciona un predictor de 50 genes para estadios precoces de CNMP. La estrategia que se utilizó para la obtención de este predictor, comenzó por una detección y/o cuantificación de la expresión génica global de tumores de CNMP en estadios tempranos (I y II) . En base a la expresión génica se realizó una clasificación molecular y una asociación con recidiva; la relación de los grupos moleculares con las variables histológicas y clínicas más importantes; la obtención de un predictor que identifica los grupos moleculares generados; la obtención de un predictor que diferencia un grupo de pacientes con buen pronóstico frente a un grupo de pacientes con mal pronóstico; y validación de los predictores con una serie externa. Finalmente, se observó que el método de la invención es útil para el pronóstico de CNMP. El predictor de la invención está constituido por 50 genes que se muestran en la tabla 1, de ahora en adelante, los denominados “50 genes de la invención”.

El término “predictor” se refiere en esta memoria a un perfil de expresión diferencial de genes o perfil de expresión génica.

Se entiende por “perfil de expresión génica” el perfil génico obtenido tras la cuantificación del producto de expresión de los genes de interés. Se entiende por “producto de expresión”, al ARN mensajero (ARNm) , el ADN complementario (ADNc) , el ARN complementario (ARNc) y/o la proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes de la tabla 1, en una muestra biológica aislada.

El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes de la tabla 1 puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) , RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR) , o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE) ; microarrays de ADN o de ARN elaborados con oligonucleótidos o sondas sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro de obtención de datos útiles para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II caracterizado por la detección y/o cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra biológica aislada de un sujeto.

2. Método según la reivindicación 1 que además comprende la comparación de los datos útiles con valores de expresión de referencia para el producto de expresión de los genes de la tabla 1 en cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II obtenidos de sujetos en los que el pronóstico es conocido (muestra de referencia) para identificación del sujeto como un sujeto de buen pronóstico o de mal pronóstico.

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2 donde la comparación se realiza mediante el método del centroide compacto más cercano.

4. Método in vitro para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II caracterizado por:

a. la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en una muestra de referencia;

b. el cálculo de un valor de referencia (valor 1) para cada producto de expresión de los genes de la tabla 1 en las muestras de referencia de pronóstico favorable (grupo de buen pronóstico) y el cálculo de un valor de referencia (valor 2) en las muestras de referencia de pronóstico desfavorable (grupo de mal pronóstico) mediante el uso del método del centroide más cercano;

c. la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra biológica de un nuevo sujeto en el que el pronóstico es desconocido (muestra de estudio) ;

d. la comparación mediante el uso del método de clasificación del centroide compacto más cercano de los valores obtenidos en la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra de estudio con los valores de referencia obtenidos en los grupos de buen y mal pronóstico.

e. la asociación de la muestra de estudio al grupo de buen pronóstico o al grupo de mal pronóstico según lo establecido en el método del centroide compacto más cercano.

5. Método según la reivindicación 4 donde el método del centroide más cercano se lleva a cabo a través de la aplicación de Predicción de Análisis de Microarrays (PAM) .

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la muestra de referencia y las muestras de estudio han sido previamente normalizadas antes de la comparación.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que además comprende la detección y/o cuantificación de al menos un producto de expresión de los genes descritos en la tabla 2.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el producto de expresión es ARN mensajero.

9. Método según la reivindicación 8 donde la detección y/o cuantificación del ARN mensajero se realiza mediante microarrays.

10. Método según la reivindicación 8 donde la detección y/o cuantificación del ARN mensajero se realiza mediante RT-PCR.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el producto de expresión es una proteína.

12. Método según la reivindicación 11 donde la detección y/o cuantificación de la proteína se realiza mediante inmuno blotting, inmunohistoquímica, cromatografía o microarrays.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la muestra biológica se selecciona de la lista que comprende: tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar o fluido ascítico.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde el sujeto es un humano.

16. Uso in vitro de los productos de expresión de los genes de la tabla 1 como marcador pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II.

17. Kit que comprende sondas que consisten en las sondas que reconocen el ARN mensajero, producto de la expresión de los genes de la tabla 1, o el ADN complementario o ARN complementario a dicho ARN mensajero, o anticuerpos que reconocen una proteína producto de expresión de los genes de la tabla 1.

18. Kit según la reivindicación 17 que comprende sondas, que consisten en las sondas que reconocen el ARN 5 mensajero producto de la expresión de los genes de la tabla 1.

19. Kit según la reivindicación 15 donde las sondas son las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ IDNO: 66.

20. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 que además comprende al menos una sonda o un anticuerpo que reconoce un producto de expresión de los genes de la tabla 2.

21. Kit según la reivindicación 20 que comprende al menos una sonda que reconoce un producto de expresión de los 10 genes de la tabla 2.

22. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 que además comprende al menos unos de los reactivos seleccionados de la lista que comprende: una retrotranscriptasa, una ARN polimerasa o un fluoróforo.

23. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22 donde las sondas están situadas en un soporte sólido.

24. Uso del kit según las reivindicaciones 17 a 23 para la obtención de datos útiles para el pronóstico del carcinoma 15 de pulmón no microcítico de estadios I o II.

FIG.3

FIG.4

FIG.5 A

FIG.7

p = 0.022

Grupo 1 (71) —— Grupo 2 (40) — — Grupo3 (51) ---

FIG.8

p = 0.001

FIG.9 A

FIG.9 B