Método de clasificación del carcinoma no microcítico de pulmón basado en la identificación de una respuesta inmune intratumoral.

Método de clasificación del carcinoma no microcítico de pulmón basado en la identificación de una respuesta inmune intratumoral.

La presente invención se refiere a un método in vitro de clasificación del carcinoma no microcítico de pulmón basado en la expresión diferencial de 50 genes. Dichos genes identifican una respuesta inmune intratumoral. Mediante el método de la invención se diferencian pacientes con un perfil de expresión de genes asociados a una respuesta inmune que se asocia con buen pronóstico y pacientes sin ese perfil de expresión que tienen peor pronóstico. Esa clasificación puede usarse como marcador pronóstico, como clasificador de los tumores en función de la respuesta inmune antitumoral ("inmunoscore") o como biomarcador predictor de terapias basadas en el sistema inmune (inmunoterapia). La presente invención también se refiere a un kit que comprende un conjunto de sondas que reconocen los 50 genes de la invención.

La presente invención se refiere a un método in vitro de clasificación del carcinoma no microcítico de pulmón basado en la expresión diferencial de 50 genes. Dichos genes identifican una respuesta inmune intratumoral. Mediante el método de la invención se diferencian pacientes con un perfil de expresión de genes asociados a una respuesta inmune que se asocia con buen pronóstico y pacientes sin ese perfil de expresión que tienen peor pronóstico. Esa clasificación puede usarse como marcador pronóstico, como clasificador de los tumores en función de la respuesta inmune antitumoral (“inmunoscore”) o como biomarcador predictor de terapias basadas en el sistema inmune (inmunoterapia) . La presente invención también se refiere a un kit que comprende un conjunto de sondas que reconocen los 50 genes de la invención. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer con una tasa anual de más de 1, 1 millones de personas en todo el mundo, y con una tasa de supervivencia a cinco años de sólo el 15%. Aproximadamente el 80% de los casos diagnosticados se clasifican como carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) y el 20% restante corresponden a carcinoma microcítico de pulmón (CMP) . En el CNMP, los tipos más frecuentes son el carcinoma epidermoide o escamoso y el adenocarcinoma.

El sistema de estadiaje TNM (7ª edición) basado en el tamaño del tumor (T) , la afectación ganglionar (N) y la presencia de metástasis a distancia (M) es, en la actualidad, el factor pronóstico más utilizado en los pacientes con CNMP. En función de estos parámetros, los tumores se clasifican en: estadio I y estadio II (en ambos casos la enfermedad es localizada) , estadio III (enfermedad localmente avanzada) y estadio IV (enfermedad metastásica) (Kligerman S. American Journal of Roentgenology 2010. 194:562-573) .

En estadios iniciales o tempranos (estadios I y II) , la cirugía con intención curativa es el tratamiento de elección encontrándose en continua discusión el beneficio de la quimioterapia adyuvante para disminuir la elevada tasa de recurrencia posterior a la resección quirúrgica que oscila entre un 30-35% de los pacientes. En concreto, en estadios II, la quimioterapia adyuvante basada en platinos, como el cisplatino, ha demostrado mejorar la supervivencia de determinados subgrupos pero, por otro lado, existe un porcentaje de pacientes que a pesar de no recaer tras la cirugía reciben tratamiento adyuvante y que son por lo tanto pacientes tratados en exceso. Este sobretratamiento repercute en problemas en estos pacientes asociados a los efectos secundarios de dichos tratamientos. Respecto a los estadios I (que engloba a los subgrupos IA y IB) , y según la guía de consenso elaborada por el “National Comprehensive Cancer Network” (NCCN) en 2011, en el subgrupo IA la quimioterapia adyuvante no está indicada, mientras que en los pacientes del subgrupo IB, sólo está recomendada en aquellos que cumplan factores de riesgo como pobre grado de diferenciación, invasión vascular, resección en cuña y márgenes mínimos. Por lo tanto, debido a la falta de precisión de los métodos actuales para definir el pronóstico de los estadios tempranos del CNMP, en la actualidad existen pacientes que reciben un tratamiento adyuvante que no les beneficia y también pacientes que no reciben un tratamiento adyuvante y que sin embargo tienen una alta probabilidad de recurrencia del tumor.

Actualmente, en el cáncer de pulmón no se conocen marcadores de probado valor pronóstico y predictivo que indiquen cúal será la progresión del paciente (Karapaniagiotou E, et al. Open Lung Cancer J 2009. 2: 24-30) . En CNMP se han desarrollado estudios que utilizan plataformas de análisis masivo para la obtención de perfiles de expresión génica que puedan ser utilizadas como biomarcadores pronóstico. Los resultados obtenidos han sido dispares en cuanto a los genes a incluir en el biomarcador, quizás debido al uso de criterios diferentes en cuanto a la inclusión de pacientes en el estudio, la obtención de muestras, la elección de los estadios tumorales, la exclusión o no de subtipos histológicos de gran importancia en el CNMP, así como a la falta, en algunos casos, de validación independiente (Roepman P. et al. Clin Cancer Res 2009. 15:284-290; Chen HY et al. New Engl J Med 2007. 356 (1) :11-20) ; Raponi M et al. Cancer Res 2006 66:7466-7472; US20090062144; WO2010007093; Raz DJ et al. Clin Cancer Res 2008 14 (17) :5565– 5570) .

Por lo tanto existe la necesidad de desarrollar una herramienta alternativa que pueda ser usada clínicamente, que sea más efectiva que los factores de riesgo estándar en identificar aquellos pacientes completamente resecados que puedan beneficiarse de la quimioterapia adyuvante y distinguirlos de aquellos clasificados como pacientes de bajo riesgo de recurrencia y en los que la quimioterapia no sería necesaria. Además, la respuesta inmune antitumoral se considera actualmente un factor relacionado con el pronóstico de los pacientes. Se requiere por lo tanto un método robusto que sea capaz de estratificar pacientes con CNMP en grupos de buen y mal pronóstico y un método de clasificación de la respuesta inmune intratumoral (“inmunoscore”) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar un método in vitro alternativo que determine la existencia de una respuesta inmune en el seno del carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) para la obtención de un tratamiento personalizado del paciente.

En la presente invención se describe un método in vitro para clasificar el CNMP que se caracteriza por la detección y/o cuantificación de un producto de expresión del conjunto de 50 genes, que se muestran en la tabla 1 en la muestra biológica de un sujeto. La presente invención también se refiere al uso de los productos de expresión de dichos 50 genes como biomarcadores pronóstico de cáncer de CNMP.

El método de la invención proporciona un predictor de 50 genes para CNMP. La estrategia que se utilizó para la obtención de este predictor, comenzó por una detección y/o cuantificación de la expresión génica global de tumores de CNMP en estadios tempranos (I y II) . En base a la expresión génica se realizó una clasificación molecular y una asociación con recidiva; la relación de los grupos moleculares con las variables histológicas y clínicas más importantes; la obtención de un predictor que identifica los grupos moleculares generados; la obtención de un predictor que diferencia un grupo de pacientes con buen pronóstico frente a un grupo de pacientes con mal pronóstico; y validación de los predictores con una serie externa. Finalmente, se observó que el método de la invención es útil para el pronóstico de CNMP. El predictor de la invención está constituido por 50 genes que se muestran en la tabla 1, de ahora en adelante, los denominados “50 genes de la invención”.

Los 50 genes de la tabla 1, están sobreexpresados en el grupo de buen pronóstico. La función descrita para dichos genes indica que su sobreexpresión se debe en gran medida a la presencia de una respuesta inmune intratumoral, lo que además se asocia a un mejor pronóstico.

Los 50 genes de la tabla 1 están relacionados en su mayor parte con elementos estructurales de las células del sistema inmune o con funciones inmunológicas (maduración, reclutamiento, proliferación y supervivencia) , sobre todo en linfocitos B y células plasmáticas intratumorales. Muchos de dichos genes codifican para las moléculas de inmunoglobulina (Ig) (cadenas pesadas y ligeras constantes, la cadena J, las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras) , el receptor de células B (CD79a) , el marcador específico de linaje de célula B (CD19) , el co-activador específico de la transcripción en las células B (POU2AF1) o el factor específico de plegado para el ensamblaje de IgM (pERp1) . También existen genes aunque no se expresan exclusivamente en las células B, tienen gran influencia en la homeostasis de este tipo celular, como el factor de maduración de las células B (TNFRSF17) , que es una diana transcripcional putativa del factor de expresión sobreexpresado POU2AF1 (Zao C. et al. 2008 Oncogene 27: 63-75) y el receptor para el factor de activación de células B (Trung Chu V. et al 2007 J. Immunol 179: 5947-5957) . Este es también el caso de SLAM7F (CD139) , que induce la proliferación y la expresión de citoquinas autocrinas sobre los linfocitos B humanos (Lee JK, et al. 2007 J Immunol. 179 (7) : 4672-8) , de CXCL13, una citoquina quimioatrayente de las células B (Sáez et al. Blood 2011, 11;118... [Seguir leyendo]

1. Uso in vitro de los productos de expresión de todos los genes de la tabla 1 para clasificar la respuesta inmune intratumoral en cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II, donde la sobreexpresión de todos los genes de la tabla 1 se asocia a una respuesta inmune intratumoral, que se asocia con buen pronóstico, mientras que la falta de sobreexpresión de todos los genes de la tabla 1 se asocia a una falta de respuesta inmune intratumoral, que se asocia con mal pronóstico.

2. Uso de un kit que comprende sondas que consisten en las sondas que reconocen el ARN mensajero, producto de la expresión de todos los genes de la tabla 1, o el ADN complementario o ARN complementario a dicho ARN mensajero, o anticuerpos que reconocen una proteína producto de expresión de todos los genes de la tabla 1 para la obtención de datos útiles para la clasificación de la respuesta inmune intratumoral del carcinoma de pulmón no microcítico de estadios I o II.

3. Uso del kit según la reivindicación 2 donde el kit comprende sondas, que consisten en las sondas que reconocen el ARN mensajero producto de la expresión de todos los genes de la tabla 1.

4. Uso del kit según la reivindicación 2 donde las sondas son las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 66.

5. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 donde dicho kit además comprende al menos unos de los reactivos seleccionados de la lista que comprende: una retrotranscriptasa, una ARN polimerasa o un fluoróforo.

6. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 donde las sondas están situadas en un soporte sólido.

7. Uso de un kit que comprende sondas que consisten en las sondas que reconocen el ARN mensajero, producto de la expresión de todos los genes de la tabla 1, o el ADN complementario o ARN complementario a dicho ARN mensajero, o anticuerpos que reconocen una proteína producto de expresión de todos los genes de la tabla 1 para la obtención de datos útiles para predecir la respuesta a inmunoterapia del carcinoma de pulmón no microcítico de estadios I o II.

8. Uso del kit según la reivindicación 7 donde el kit comprende sondas, que consisten en las sondas que reconocen el ARN mensajero producto de la expresión de todos los genes de la tabla 1.

9. Uso del kit según la reivindicación 7 donde las sondas son las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 66.

10. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde dicho kit además comprende al menos unos de los reactivos seleccionados de la lista que comprende: una retrotranscriptasa, una ARN polimerasa o un fluoróforo.

11. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 donde las sondas están situadas en un soporte sólido.

FIG. 1

p = 0.989

FIG. 2

FIG.3

FIG.4

FIG. 5 A

FIG.5 B

FIG 6

FIG.8

FIG.9 A

p 0.029

nó ós

FIG.9 B

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Clínico San Carlos <120> Método de clasificación del carcinoma no microcítico de pulmón basado en la identificación de una respuesta inmune intratumoral

<130> ES2604.1BIS

<160> 66

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para AMPD1

<400> 1 ggaatttctc atgaggagaa agtaaagttt ctgggcgaca attaccttga ggaaggccct 60

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para TNFRSF17

<400> 2 gatctcttta ggatgactgt atttttcagt tgccgataca gctttttgtc ctctaactgt 60

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CD19

<400> 3 tacatgccag tgacacttcc agtccccttt gtattcctta aataaactca atgagctctt 60

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CD27

<400> 4

agccacaact gcagtcccat cctcttgtca gggccctttc ctgtgtacac gtgacagagt 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CD38

<400> 5

tgaaaaatcc tgaggattca tcttgcacat ctgagatctg agccagtcgc tgtggttgtt 60

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CD79A

<400> 6

tgattgtagc agcctcgtta gtgtcacccc ctcctccctg atctgtcagg gccacttagt 60

<210> 7

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CD79B

<400> 7

cgctgaagga tggtatcatc atgatccaga cgctgctgat catcctcttc atcatcgtgc 60

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para GZMB

<400> 8

aaccatgaaa cgctactaac tacaggaagc aaactaagcc cccgctgtaa tgaaacacct 60

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHA1

<400> 9

tctatgatag tagtggtccc tttgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct 60

<210> 10

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHA2, sonda 1

<400> 10

gagttgaaga ccccactaac cgccaacatc acaaaatccg gaaacacatt ccggcccgag 60

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHG1, sonda 1

<400> 11

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 60

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGJ

<400> 12

ttgggtgatg taaaaccaac tccctgccac caaaataatt aaaatagtca cattgttatc 60

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGL@, sonda 1

<400> 13

cccaaggcat caagcccttc tcccgtgcac tcaataaacc ctcaataaat attctcattt 60

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGLL1, sonda 1

<400> 14

aacaaggcca cactggtgtg tctcatgaat gacttctatc tgggaatctt gacggtgacc 60

<210> 15

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda pra IRF4

<400> 15

ttttgtattg attttcacag ctttgaggaa catgcataag aaatgtagct gaagtagagg 60

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para KCNN3

<400> 16

agtgaccaag ccaacactct ggtggacctt tccaagatgc agaatgtcat gtatgactta 60

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda pra KRT81

<400> 17

ttgaaagacc cctcccactc ctggcctcac atttctctgt gtgatccccc acttctgggc 60

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CXCL9

<400> 18

tgtgacccac ttaccttgca tctcacaggt agacagtata taactaacaa ccaaagacta 60

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para PNOC

<400> 19

gccactgcca taacttgttt gtaaaagagc tgttcttttt gactgattgt tttaaacaac 60

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda pra POU2AF1

<400> 20

ttttctggga aatgactttt ctgggaaatg acagtttctt tgacatattt tctttgccca 60

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda pra BFSP2

<400> 21

ctgaaaagct tcctggaagt ggagagatcc ttctgcttta atctgagtag tctgtagctt 60

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para KIAA0125, sonda 1

<400> 22

acattgggaa gggatggagg atggacggag gaaggacgtg cagttgcagc tctttctgca 60

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CXCL13

<400> 23

caagaggcaa aggaatccat gtagtagata tcctctgctt aaaaactcac tacggaggag 60

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para PIM2

<400> 24

ggtgagggga ccctactttg ttatcccaag tgctcttatt ctggtgagaa gaaccttaat 60

<210> 25

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para SMR3A

<400> 25

caccctatgg tccagggaga attcaatcac actctcttcc tcctccttat ggcccaggtt 60

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGKV1D-8

<400> 26

gtctgaagat tttgcaactt attactgtca acagtattat agtttccctc cgacgttcgg 60

<210> 27

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para MGC29506

<400> 27

ggacatgttt gcactacttg ggggagtttg gagaagacca gatctatgaa gcccaccaac 60

<210> 28

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para FKBP11

<400> 28

ttctcacttg gcctatggaa aacggggatt tccaccatct gtcccagcgg atgcagtggt 60

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda prara LAX1, sonda 1

<400> 29

tagagaagag atgtcaaatg aggactccag tgactatgaa aatgtgctaa ctgccaagtt 60

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para CPNE5

<400> 30

tggttctgtg cccgtctctg agacagtctc tgtgtggaat ttgccttaaa ctgaagtaaa 60

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para SLAMF7

<400> 31

ggagacctcc ctaccaagtg atgaaagtgt tgaaaaactt aataacaaat gcttgttggg 60

<210> 32

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para DUSP26

<400> 32

ccaaaaacat acagaggtgc atggctggca gtcttgaaat tgtcactcgc ttactggatc 60

<210> 33

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para FCRL2, sonda 1

<400> 33

gaggaatcag aagggaagat caacagcaag gatggggcat cattaagact tgctataaaa 60

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para FER1L4

<400> 34

gaagtctttc ttacccatgt gagctacccc agagtctagt gcttcctctg aataaaccta 60

<210> 35

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para FCRL5, sonda 1

<400> 35

gatatccatc acatcttatc ttgatctttg ctcccagtgg attgtacagt gatgactttt 60

<210> 36

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para FCRLA

<400> 36

gacataccag tctttagctg gtgctatggt ctgttcttta gttctagttt gtatcccctc 60

<210> 37

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC90925

<400> 37

ctggagtgga tggggagcat ctatcctggg aactctgata ccagatacag cccatccttc 60

<210> 38

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para DERL3, sonda 1

<400> 38

tggggacacc tccctattac agatgagaac agaggggaca tgaactcctt ggaggcaggg 60

<210> 39

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para MTSS1L, sonda 1

<400> 39

gcccatcgtc cctgtgaaga cgcccacggt gcctgactcc cccggctaca tggggcccac 60

<210> 40

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para JSRP1

<400> 40

gagaggcctc ggagagaggg gaagccgcgg aaggagaagc cgcggaagga ggagagacct 60

<210> 41

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para C5ºrf20

<400> 41

aacccagccc agttaagagg agatgccgaa tttaatgaac cctatttgaa ttgcagggct 60

<210> 42

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para MEI1

<400> 42

agaatgagac ctggagacaa agggcataat tgttggggaa atggatgaca gctgaagcta 60

<210> 43

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para GPR114

<400> 43

gtggacaaac cactcagcct ctgtgtgcct cagttttcct atttgtaaaa tagaggccat 60

<210> 44

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC401847

<400> 44

ctgtgaaggg cagattcacc atctccacag acaactcaaa gaacacgctc tacctgcaaa 60

<210> 45

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC642424

<400> 45

cagcagcctg cagcctgaag attttgcagc ttattactgt caacagagtg acagtacccc 60

<210> 46

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC100132941

<400> 46

attaaaaggt gtccagtgtg aggttcagct ggtgcagtct gggggaggct tggtacatcc 60

<210> 47

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC100133862

<400> 47

caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggaaggatca tccctatcct tggtatagca 60

<210> 48

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC100287723

<400> 48

gcagattaca ctctcaccat ccgcagcctg cagcctgaag attttgcaaa ttattactgt 60

<210> 49

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC100290415

<400> 49

acacagtcta catggagctg agaagcctga gatctgagga cacggccgtg tattactgtg

<210> 50

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LOC100293440

<400> 50 catcactggt ctccaggctg aggacgaggc tgattattac tgcagctcat atacaagcag 60

<210> 51

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHA2, sonda 2

<400> 51 gtaaacccac ccacatcaat gtgtctgttg tcatggcgga ggcggatggc acctgctact 60

<210> 52

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHA2, sonda 3

<400> 52 tgagaggaaa gttcttcacc atggactgga cctggagggt cttctgcttg ctggctgtag 60

<210> 53

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHA2, sonda 4

<400> 53 acagaagttc cagggcagag tcaccatgac cagggacacg tccacgagca cagtctacat 60

<210> 54

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHG1, sonda 2

<400> 54

agtttgggct gagctgcctt tttcttgtgg ctattttaaa aggtgtccag tgtgaggtgc

<210> 55

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHG1, sonda 3

<400> 55 atggagtttg ggctgagctg ggttgtcctc gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60

<210> 56

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGHG1, sonda 4

<400> 56 tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 60

<210> 57

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGL@, sonda 2

<400> 57 aagcccttct ccctgcactc aataaaccct caataaatat tctcattgtc aatcaaaaag 60

<210> 58

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGL@, sonda 3

<400> 58 aagatagcag ccccgtcaag cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa 60

<210> 59

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para IGLL1, sonda 2

<400> 59

tccaagccaa caaggctaca ctggtgtgtc tcatgaatga cttttatccg ggaatcttga 60

<210> 60

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para KIAA0125, sonda 2

<400> 60

ccattttaaa gatggctact taggaccata tggatgttgt actgatgtca tttgaccacg 60

<210> 61

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LAX1, sonda 2

<400> 61

atttgtaatt ttgtaaaccc tgtctctcat attttgtaaa aataccaaaa ttagcggtgg 60

<210> 62

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para LAX1, sonda 3

<400> 62

tcgcacatga ctgtttatag cagcttcatt cataattacc aaaaactaga aataacccag 60

<210> 63

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para FCRL2, sonda 2

<400> 63

catgacagct ggagttctct ggggactgtt tggtgtcctt ggtttcactg gtgttgcttt 60

<210> 64

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para FCRL5, sonda 2

<400> 64

tggcatatgg actgaaagaa actatgctat tggatctcct ggatctccag cttgctgact 60

<210> 65

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para DERL3, sonda 2

<400> 65

aggcctaaga ggcttctggc agcttccatc ctacccatga cccctacttg gggcagaaaa 60

<210> 66

<211> 60

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda para MTSS1L, sonda 2

<400> 66

tcccatctga accatttgtt tcttttcttt ccgtcagatt ttggaaaaat tctcctctcc 60